시작하려면 0일차에 Cytokine 1개를 섭씨 37도까지 혼합하여 무혈청 분화 배지 또는 SFD 배지를 미리 데웁니다. 그런 다음 멸균 조직 배양 후드 아래에서 Mix 1 사이토카인 보충 배지를 세포 퇴치제 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 세포를 준비하려면 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 IPS 세포가 들어 있는 6웰 플레이트에서 배양 배지를 흡인합니다.
DPBS로 세척한 후 DPBS를 흡입합니다. 그런 다음 해리 시약을 세포에 추가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 이 해리 시약을 흡인한 후 실온에서 3분 더 세포를 배양합니다.
그런 다음 셀이 들어 있는 플레이트를 양쪽에서 10번 두드려 셀 클러스터를 분리합니다. 웰당 1mL의 미리 데워진 Mix 1 사이토카인 보충 SFD 배지를 세포에 추가합니다. 목초지 피펫을 사용하여 세포 클러스터를 각 웰에서 Mix 1 사이토카인이 포함된 배지가 포함된 세포 퇴치 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.
플레이트를 인큐베이터에 도입한 후 앞뒤로 움직여 내용물을 고르게 분산시키고 배아체 또는 EB 형성을 위해 배양합니다. 다음 날, EB가 들어있는 세포 퇴치판을 휘저어 웰 중앙으로 모으십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 EB 현탁액을 웰에서 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.
EB가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 5-10분 정도 기다립니다. 한편, 세포 퇴치 플레이트를 멸균수 또는 DPBS로 세척하여 단일 세포 또는 파편을 제거합니다. Mix 1 사이토카인이 보충된 SFD 배지 2mL를 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
이제 EB를 빼지 않고 원심분리기 튜브에서 상층액을 부드럽게 흡입합니다. Mix 1 사이토카인을 함유하는 SFD 배지의 계산된 부피에 EB를 재현탁시킵니다. 이미 2밀리리터의 배지를 함유하고 있는 세척된 세포 퇴치 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 EB 현탁액을 추가합니다.
EB를 분산시킨 후 플레이트를 앞서 언급한 대로 플레이트를 부드럽게 움직여 배양합니다. 웰 중앙에 EB를 모은 후 세포와의 직접적인 접촉을 피하고 각 웰의 측면에 키론을 추가하고 앞에서 설명한 대로 웰을 배양합니다. 분화 3일차와 6일차에 EB를 수집하고 1일차에 앞서 설명한 대로 배지 변경을 수행합니다.
3일차에는 Mix 3 사이토카인이 보충된 SFD 배지를 사용하고 6일차에는 Mix 4 사이토카인이 보충된 SFD 배지를 사용합니다. 앞서 설명한 바와 같이 세포 발수판에서 EB를 수집하여 15밀리리터 원심분리기 튜브에 침전시킨 후 상층액을 흡인한 다음 튜브에 수집된 EB 웰당 1밀리리터의 세포 해리 시약을 추가하여 EB를 재현탁시킵니다. 다음으로, 이 EB 현탁액 1밀리리터를 물로 세척한 세포 발수 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
인큐베이터에서 플레이트를 10분 동안 배양한 후 P1000 피펫을 사용하여 위아래로 10회 이상 부드럽게 피펫팅하여 각 웰의 EB를 해리합니다. 그런 다음 해리된 EB의 웰당 5밀리리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 세포를 40미크론 스트레이너를 통과시켜 50밀리리터 원심분리기 튜브에 모읍니다.
여과된 현탁액의 세포를 계수한 후 300g에서 10분 동안 세포를 회전시킵니다. 300 마이크로리터의 세척 버퍼에 세포를 재현탁하여 몇 번 부드럽게 피펫팅하여 덩어리가 없는지 확인합니다. 제조업체의 지침에 따라 CD34 마이크로비드 키트를 사용하여 CD34 양성 세포를 분리합니다.
좋은 품질의 EB는 분화 2일차에 뚜렷한 우위를 보였으며 현미경으로 관찰했을 때 선명하고 밝게 나타났습니다. 더 어두운 영역의 존재는 EB 내에서 세포 사멸을 나타냅니다. 2일차에 다양한 농도로 키론 처리를 한 후, 분화 8일째에 CD34 양성 세포의 수를 정량화하여 치료에 대한 세포주의 반응을 나타냈습니다.
유세포 분석은 마그네틱 비드를 사용한 CD34 양성 농축이 약 85%의 CD34 양성 세포를 제공한다는 것을 보여주었습니다.