For å begynne, på dag null, forvarmer serumfritt differensieringsmedium eller SFD-medium som inneholder Mix 1 cytokin til 37 grader Celsius. Deretter, under en steril vevskulturhette, tilsett Mix 1 cytokin-supplert medium til hver brønn i en celleavvisende seksbrønnsplate. For å forberede cellene, aspirer kulturmediet fra en seksbrønnsplate som inneholder menneskeinduserte pluripotente stamceller eller humane IPS-celler.
Vask dem med DPBS etterfulgt av å aspirere DPBS. Deretter tilsettes dissosiasjonsreagenset til cellene og inkuberer dem ved romtemperatur i et minutt. Etter å ha aspirert dette dissosiasjonsreagenset, inkuber cellene i ytterligere tre minutter ved romtemperatur.
Trykk deretter på platen som inneholder cellene 10 ganger på hver side for å løsne celleklyngene. Tilsett en milliliter forvarmet Mix 1 cytokin-supplert SFD-medium til cellene per brønn. Bruk en beitepipette til å overføre celleklyngene fra hver brønn til en brønn i den celleavvisende platen som inneholder mediet med Mix 1-cytokin.
Etter å ha introdusert platen i inkubatoren, flytt den frem og tilbake, så vel som side til side, for å spre innholdet jevnt og inkubere det for embryoidlegemer, eller EB, dannelse. Neste dag virvler du den celleavvisende platen som inneholder EB-ene for å samle dem inn i midten av brønnene. Bruk en pasteurpipette til å overføre EB-suspensjonen fra brønnene til et 15 milliliter sentrifugerør.
Vent fem til 10 minutter til EB-ene har lagt seg i bunnen av røret. I mellomtiden vasker du de celleavvisende platene med sterilt vann eller DPBS for å fjerne enkeltceller eller rusk. Tilsett to milliliter Mix 1 cytokin-supplert SFD-medium til hver brønn på platen.
Aspirer nå supernatanten forsiktig fra sentrifugerøret uten å løsne EB-ene. Resuspender EBs i beregnet volum av SFD-medium inneholdende Mix 1 cytokin. Tilsett en milliliter EB-suspensjon til hver brønn i den vaskede celleavstøtende platen som allerede inneholder to milliliter medium.
Inkuber platen etter å ha spredt EB-ene ved å bevege platen forsiktig som nevnt tidligere. Etter å ha samlet EB-ene i midten av brønnene, legg chiron på siden av hver brønn, unngå direkte kontakt med cellene, Inkuber brønnene som vist tidligere. På dag tre og seks av differensiering, samle EBs og utføre medieendringer som vist tidligere for dag én.
Bruk SFD-medium supplert med Mix 3-cytokiner på dag tre og bruk SFD-medium supplert med Mix 4-cytokiner på dag seks. Etter å ha samlet og sedimentert EB-ene fra den celleavvisende platen i et 15-milliliters sentrifugerør, som vist tidligere, aspirer supernatanten, og tilsett deretter en milliliter celledissosiasjonsreagens per brønn av EB samlet i røret for å resuspendere EB-ene. Deretter overfører du en milliliter av denne EB-suspensjonen til hver brønn på den celleavvisende platen som vaskes med vann.
Etter å ha inkubert platen i 10 minutter i inkubatoren, bruk en P1000-pipette for å dissosiere EB-ene i hver brønn ved å pipettere forsiktig opp og ned ikke mer enn 10 ganger. Tilsett deretter fem milliliter vaskebuffer per brønn med dissosierte EB-er. Samle cellene i et 50 milliliter sentrifugerør ved å føre dem gjennom en 40-mikron sil.
Etter å ha talt cellene i den filtrerte suspensjonen, spinn cellene ned i 10 minutter ved 300g. Resuspender cellene i 300 mikroliter vaskebuffer ved å pipettere forsiktig noen ganger, slik at det ikke er klumper til stede. Fortsett å isolere de CD34-positive cellene ved hjelp av et CD34-mikroperlesett i henhold til produsentens instruksjoner.
EB av god kvalitet viste en definert kant ved dag to av differensieringen og virket klar og lys når den ble observert under et mikroskop. Tilstedeværelsen av mørkere områder indikerte celledød i EBs. Etter chironbehandling med varierende konsentrasjoner på dag to, viste kvantifisering av antall CD34-positive celler ved dag åtte av differensiering cellelinjens respons på behandlingen.
Flowcytometri viste at CD34-positiv anrikning med magnetkulene ga ca. 85 % CD34-positive celler.