Till att börja med, dag noll, förvärmt serumfritt differentieringsmedium eller SFD-medium som innehåller Mix 1-cytokin till 37 grader Celsius. Tillsätt sedan det cytokinberikade mediet Mix 1 under en steril vävnadsodlingshuv till varje brunn på en cellavvisande platta med sex brunnar. För att förbereda cellerna aspirerar man odlingsmediet från en platta med sex brunnar som innehåller humaninducerade pluripotenta stamceller eller humana IPS-celler.
Tvätta dem med DPBS följt av aspirering DPBS. Tillsätt sedan dissociationsreagenset till cellerna och inkubera dem i rumstemperatur i en minut. Efter att ha aspirerat detta dissociationsreagens, inkubera cellerna i ytterligare tre minuter vid rumstemperatur.
Knacka sedan på plattan som innehåller cellerna 10 gånger på varje sida för att lossa cellklustren. Tillsätt en milliliter förvärmt Mix 1 cytokin-kompletterat SFD-medium till cellerna per brunn. Använd en betespipett och överför cellklustren från varje brunn till en brunn på den cellavvisande plattan som innehåller mediet med Mix 1-cytokin.
Efter att ha fört in plattan i inkubatorn, flytta den fram och tillbaka, såväl som från sida till sida, för att fördela innehållet jämnt och inkubera det för embryoidkroppar, eller EB, bildning. Nästa dag, snurra den cellavvisande plattan som innehåller EB för att samla in dem i mitten av brunnarna. Använd en pasteurpipett och överför EB-suspensionen från brunnarna till ett 15-milliliters centrifugrör.
Vänta fem till 10 minuter tills EB har lagt sig i botten av röret. Tvätta under tiden de cellavvisande plattorna med sterilt vatten eller DPBS för att ta bort enstaka celler eller skräp. Tillsätt två milliliter Mix 1 cytokin-kompletterat SFD-medium till varje brunn på plattan.
Aspirera nu försiktigt supernatanten från centrifugröret utan att lossa EB:erna. Återsuspendera EB i den beräknade volymen SFD-medium som innehåller blandning 1-cytokin. Tillsätt en milliliter EB-suspension till varje brunn på den tvättade cellavvisande plattan som redan innehåller två milliliter medium.
Inkubera plattan efter att ha spridit EB genom att försiktigt flytta plattan som nämnts tidigare. Efter att ha samlat EB i mitten av brunnarna, tillsätt chiron på sidan av varje brunn, undvik direktkontakt med cellerna, inkubera brunnarna som visats tidigare. På dag tre och sex av differentieringen samlar du in EB:erna och utför medieändringar som visats tidigare för dag ett.
Använd SFD-medium kompletterat med Mix 3-cytokiner på dag tre och använd SFD-medium kompletterat med Mix 4-cytokiner på dag sex. Efter att ha samlat upp och sedimenterat EB från den cellavvisande plattan i ett 15-milliliters centrifugrör, som visats tidigare, aspirera supernatanten och tillsätt sedan en milliliter celldissociationsreagens per brunn av EB som samlats upp i röret för att återsuspendera EB. Överför sedan en milliliter av denna EB-suspension till varje brunn på den cellavvisande plattan som tvättats med vatten.
Efter att ha inkuberat plattan i 10 minuter i inkubatorn, använd en P1000-pipett för att dissociera EB i varje brunn genom att försiktigt pipettera upp och ner högst 10 gånger. Tillsätt sedan fem milliliter tvättbuffert per brunn med dissocierade EB. Samla cellerna i ett 50-milliliters centrifugrör genom att föra dem genom en 40-mikronsil.
Efter att ha räknat cellerna i den filtrerade suspensionen, snurra cellerna nedåt i 10 minuter vid 300 g. Återsuspendera cellerna i 300 mikroliter tvättbuffert genom att försiktigt pipettera några gånger, se till att det inte finns några klumpar. Fortsätt att isolera de CD34-positiva cellerna med hjälp av ett CD34-mikropärlkit enligt tillverkarens instruktioner.
EB av god kvalitet visade en definierad kant på dag två av differentieringen och verkade tydliga och ljusa när de observerades i mikroskop. Förekomsten av mörkare områden indikerade celldöd inom EB. Efter chironbehandling med varierande koncentrationer dag två, kvantifiering av antalet CD34-positiva celler vid dag åtta av differentieringen avslöjade cellinjens svar på behandlingen.
Flödescytometri visade att den CD34-positiva anrikningen med hjälp av de magnetiska pärlorna gav cirka 85 % CD34-positiva celler.
