Başlamak için, sıfırıncı günde, serum içermeyen farklılaşma ortamını veya Mix 1 sitokini 37 santigrat dereceye kadar karıştıran SFD ortamını önceden ısıtın. Daha sonra, steril bir doku kültürü başlığı altında, hücre itici altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna Mix 1 sitokin takviyeli ortamı ekleyin. Hücreleri hazırlamak için, kültür ortamını insan kaynaklı pluripotent KÖK hücreler veya insan IPS hücreleri içeren altı oyuklu bir plakadan aspire edin.
Bunları DPBS ile yıkayın ve ardından DPBS'yi aspire edin. Ardından, ayrışma reaktifini hücrelere ekleyin ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu ayrışma reaktifini aspire ettikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika daha inkübe edin.
Ardından, hücre kümelerini ayırmak için hücreleri içeren plakaya her iki tarafa 10 kez dokunun. Hücrelere bir mililitre önceden ısıtılmış Mix 1 sitokin takviyeli SFD ortamı ekleyin. Bir mera pipeti kullanarak, hücre kümelerini her bir oyuktan Mix 1 sitokin içeren ortamı içeren hücre kovucu plakanın bir oyuğuna aktarın.
Plakayı inkübatöre soktuktan sonra, içeriği eşit şekilde dağıtmak ve embriyoid cisimler veya EB oluşumu için inkübe etmek için ileri geri ve yan yana hareket ettirin. Ertesi gün, EB'leri içeren hücre kovucu plakayı yuvaların ortasına toplamak için döndürün. Bir pastör pipeti kullanarak, EB süspansiyonunu kuyulardan 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
EB'lerin tüpün dibine yerleşmesi için beş ila 10 dakika bekleyin. Bu arada, tek hücreleri veya kalıntıları temizlemek için hücre kovucu plakaları steril su veya DPBS ile yıkayın. Plakanın her bir oyuğuna iki mililitre Mix 1 sitokin takviyeli SFD ortamı ekleyin.
Şimdi, EB'leri yerinden çıkarmadan süpernatanı santrifüj tüpünden nazikçe aspire edin. Karışım 1 sitokin içeren hesaplanan SFD ortamı hacmindeki EB'leri yeniden süspanse edin. Zaten iki mililitre ortam içeren yıkanmış hücre itici plakanın her bir oyuğuna bir mililitre EB süspansiyonu ekleyin.
EB'leri dağıttıktan sonra plakayı daha önce belirtildiği gibi hafifçe hareket ettirerek plakayı inkübe edin. EB'leri kuyucukların merkezinde topladıktan sonra, hücrelerle doğrudan temastan kaçınarak her bir kuyucuğun yan tarafına chiron ekleyin, kuyuları daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. Farklılaşmanın üçüncü ve altıncı günlerinde, EB'leri toplayın ve daha önce birinci gün için gösterildiği gibi medya değişiklikleri gerçekleştirin.
Üçüncü günde Mix 3 sitokinleri ile desteklenmiş SFD ortamını kullanın ve altıncı günde Mix 4 sitokinleri ile desteklenmiş SFD ortamını kullanın. EB'leri hücre kovucu plakadan topladıktan ve daha önce gösterildiği gibi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirdikten sonra, süpernatanı aspire edin, ardından EB'leri yeniden süspanse etmek için tüpte toplanan EB oyuğu başına bir mililitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin. Daha sonra, bu EB süspansiyonunun bir mililitresini suyla yıkanmış hücre itici plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.
Plakayı inkübatörde 10 dakika inkübe ettikten sonra, 1000 defadan fazla olmamak üzere hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek her bir oyuktaki EB'leri ayırmak için bir P10 pipeti kullanın. Ardından, ayrışmış EB'lerin kuyucuğu başına beş mililitre yıkama tamponu ekleyin. Hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın.
Filtrelenmiş süspansiyondaki hücreleri saydıktan sonra, hücreleri 300 g'da 10 dakika aşağı döndürün. Hücreleri 300 mikrolitre yıkama tamponunda birkaç kez hafifçe pipetleyerek yeniden süspanse edin ve topak kalmadığından emin olun. Üreticinin talimatlarına göre bir CD34 mikroboncuk kiti kullanarak CD34 pozitif hücreleri izole etmeye devam edin.
İyi kalitede EB'ler, farklılaşmanın ikinci gününde tanımlanmış bir kenar gösterdi ve mikroskop altında gözlemlendiğinde net ve parlak görünüyordu. Daha koyu alanların varlığı, EB'ler içinde hücre ölümünü gösterdi. İkinci günde değişen konsantrasyonlarda chiron tedavisini takiben, farklılaşmanın sekizinci gününde CD34 pozitif hücrelerin sayısının ölçülmesi, hücre hattının tedaviye yanıtını ortaya çıkardı.
Akış sitometrisi, manyetik boncuklar kullanılarak yapılan CD34-pozitif zenginleştirmenin yaklaşık% 85 CD34-pozitif hücreler sağladığını gösterdi.
