For å begynne, plasser den monterte mikro-sim-enheten i sterile slangeklemmer. Dyrk enheten i en stor steril petriskål. For ekstra fuktighet, plasser et 50 milliliter konisk rørlokk fylt med sterilt vann.
For å forberede enheten for celledyrking, skyll toppkammeret med 100 mikroliter vann. Deretter skal du lage en beleggløsning ved å blande kollagen fire, bovin fibronektin og sterilt vann. Fjern vannet fra toppkammeret og tilsett 100 mikroliter beleggløsning.
Inkuber kammeret ved 37 grader Celsius i to til fire timer. Etter inkubering, erstatt beleggløsningen i toppkammeret med 100 mikroliter romtemperatur HECSR. Tilsett 20 mikroliter HECSR-oppløsning i bunnkammeret.
For å passere, EECM-BMEC som celler, tilsett en celledetachment enzymblanding til cellene og inkubere ved 37 grader Celsius i fem til åtte minutter. Deretter pipetterer du cellesuspensjonen og legger den til fire ganger volumet av endotelmediet i et sentrifugerør. Sentrifuge ved 200G i fem minutter og re-suspendere cellene i en milliliter HECSR.
Frø cellene med en tetthet på 40.000 celler per kvadratcentimeter i toppkammeret og inkuber ved 37 grader Celsius i to til fire timer for å lette celleadhesjon. Etter inkubering, bytt mediet med frisk HECSR i begge kamre. Fest cellene ved å tilsette 20 mikroliter 100% metanol, avkjølt ved minus 20 grader Celsius i bunnkammeret og 50 mikroliter i toppkammeret.
Inkuber enheten ved romtemperatur i to til 10 minutter. Deretter vasker du cellene ved å tilsette 20 mikroliter PBS i bunnkammeret og 100 mikroliter i toppkammeret. Etter hver vask, bekreft mangelen på bobler i bunnkammeret.
Blokker cellene i 30 minutter ved å tilsette 20 mikroliter av blokkeringsløsningen i bunnkammeret og 50 mikroliter i toppkammeret. Etter blokkering, erstatt volumet i toppkammeret med 50 mikroliter av den primære antistoffoppløsningen og inkuber i en time ved romtemperatur. Etter PBS-vask, tilsett 50 mikroliter av den sekundære antistoffoppløsningen i toppkammeret og inkuber i en time beskyttet mot lys.
Etter PBS-vask, tilsett 50 mikroliter Hoechst til toppkammeret og inkuber i tre minutter. Deretter tilsettes 20 mikroliter PBS til bunnkammeret og 100 mikroliter til toppkammeret. Bilde enheten umiddelbart på et konfokalmikroskop.
Finn membranvinduet med en våt lang arbeidsavstand 40x objektiv og bytt til fluorescenskanaler for å sjekke Hoechst og kryssfarging. Optimal setetetthet for HIPSC-cellekultur og underseed BPLC er demonstrert her. Den HIPSC-avledede samkulturen var lettere å skille i fasekontrastavbildning enn primære kokulturer.
Lav BPLC-såing resulterer i dårlig parasittdekning og klumping mens overspising fører til at parasittlaget skreller av membranen. I immunfarget HIPSC-avledet celle-kokultur ble to lag med celler sett i umiddelbar nærhet, kun adskilt av en tynn silisiumnitrid nanomembran. I permeabilitetsanalysen indikerer høy variasjon i permeabiliteten til endotelcellene dyrket i to dager at to dager med kultur ikke var tilstrekkelig for barrieremodning.
Videre var det ingen signifikante forskjeller i permeabilitet mellom laboratoriene ved barrieremodning fra fire dager av.
