Для начала поместите собранное устройство micro sim в стерильные хомуты для шлангов. Культивируйте прибор в большой стерильной чашке Петри. Для дополнительной влажности поместите крышку конической пробирки объемом 50 миллилитров, наполненную стерильной водой.
Чтобы подготовить устройство для культивирования клеток, промойте верхнюю камеру 100 микролитрами воды. Затем приготовьте обволакивающий раствор, смешав четвертый коллаген, бычий фибронектин и стерильную воду. Удалите воду из верхней камеры и добавьте 100 микролитров лакокрасочного раствора.
Инкубируйте камеру при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов. После инкубации замените раствор покрытия в верхней камере на 100 микролитров HECSR комнатной температуры. Добавьте 20 микролитров раствора HECSR в нижнюю камеру.
Чтобы пройти, EECM-BMEC подобные клетки, добавьте к клеткам смесь ферментов для отслоения клеток и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-восьми минут. Далее пипетку пропилетом наносят клеточной суспензии и добавляют ее в четырехкратный объем эндотелиальной среды в центрифужную пробирку. Центрифугу при 200G в течение пяти минут и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре HECSR.
Высейте клетки с плотностью 40 000 клеток на квадратный сантиметр в верхней камере и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов, чтобы облегчить адгезию клеток. После инкубации замените среду свежим HECSR в обеих камерах. Зафиксируйте ячейки, добавив 20 микролитров 100% метанола, охлажденного при минус 20 градусах Цельсия, в нижнюю камеру и 50 микролитров в верхнюю камеру.
Инкубируйте прибор при комнатной температуре от двух до 10 минут. Далее промойте клетки, добавив 20 микролитров PBS в нижнюю камеру и 100 микролитров в верхнюю камеру. После каждой стирки проверяйте отсутствие пузырьков в нижней камере.
Заблокируйте ячейки на 30 минут, добавив 20 микролитров блокирующего раствора в нижнюю камеру и 50 микролитров в верхнюю камеру. После блокировки замените объем в верхней камере 50 микролитрами раствора первичного антитела и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки PBS добавьте 50 микролитров раствора вторичных антител в верхнюю камеру и инкубируйте в течение одного часа в защищенном от света месте.
После промывки PBS добавьте в верхнюю камеру 50 микролитров Hoechst и инкубируйте в течение трех минут. Затем добавьте 20 микролитров PBS в нижнюю камеру и 100 микролитров в верхнюю камеру. Изображение прибора сразу же на конфокальном микроскопе.
Найдите мембранное окно с помощью влажного длинного рабочего объектива с 40-кратным увеличением и переключитесь на флуоресцентные каналы, чтобы проверить окрашивание по Хёхсту и окрашиванию переходов. Здесь продемонстрирована оптимальная плотность посадки для культуры клеток HIPSC и подсеменного ПЖХ. Кокультуру, полученную с помощью HIPSC, было легче различить при фазово-контрастной визуализации, чем первичные кокультуры.
Низкий посев BPLC приводит к плохому покрытию паразитами и слипанию, в то время как переедание приводит к отслаиванию паразитарного слоя от мембраны. В иммуноокрашенной культуре клеток, полученных из HIPSC, два слоя клеток были замечены в непосредственной близости, разделенные только тонкой наномембраной из нитрида кремния. В анализе проницаемости высокая вариабельность проницаемости эндотелиальных клеток, культивируемых в течение двух дней, указывает на то, что двух дней культивирования было недостаточно для созревания барьера.
Кроме того, не было выявлено существенных различий в проницаемости между лабораториями при созревании барьера через четыре дня.
