Begynd med at nedsænke den delte musenethinde med fastgjorte nitrocellulosemembraner i 4% paraformaldehyd på is i 30 minutter. Udskift derefter paraformaldehydet med 5 til 10 ml stuetemperatur PBS for at vaske de delte nethinder. Før du fjerner den delte nethinden fra nitrocellulosen, skal du bruge en hydrofob barrierepen til at forberede cirkulære brønde på et mikroskopglas.
Lad brøndene lufttørre i 5 til 10 minutter. Derefter placeres de delte nethinden i de forberedte brønde og tilsættes nok PBS til at nedsænke dem. Under et dissektionsmikroskop løftes forsigtigt vævets kanter med en fin pensel og cirkler rundt om nethinden for at adskille den fra membranen.
Brug tang og penslen til at fjerne membranen under det flydende stykke nethinden. Derefter forsigtigt aspirere væk de resterende PBS, så retinal væv hviler på mikroskopet glide ganglion celle side nedad. Immunofluorescensmærkning af synaptophysin over toppen af den delte nethinden indikerede, at fotoreceptorsynaptiske terminaler blev bevaret.
Imidlertid var fotoreceptorkerner fraværende, hvilket bekræftede nethinden opdelt gennem fotoreceptoraxonerne. Synaptisk integritet blev vurderet ved at mærke RGS11 i ON-BC dendritter og CtBP2 i fotoreceptor synaptiske bånd. Spaltning beskadigede ikke morfologien af fotoreceptorterminaler i det ydre plexiformlag.
RBC-levedygtighed i den delte nethinden blev vurderet ved hjælp af et nær infrarødt nukleært farvestof. Regional variabilitet i cellelevedygtighed på tværs af vævet blev observeret med højere celledød i nogle områder, hvor de fleste RBC'er forblev levedygtige efter opdeling. Immunofluorescensmærkning af RBC'er mod PKC alfa og vandrette celler mod Calbindin-D viste hurtig antistofdiffusion i den delte nethinden efter en times inkubation.
