Commencez par immerger la rétine de souris fendue avec les membranes de nitrocellulose attachées dans du paraformaldéhyde à 4 % sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez le paraformaldéhyde par 5 à 10 millilitres de PBS à température ambiante pour laver les rétines fendues. Avant de retirer la rétine fendue de la nitrocellulose, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour préparer des puits circulaires sur une lame de microscope.
Laissez les puits sécher à l’air libre pendant 5 à 10 minutes. Ensuite, placez les rétines fendues dans les puits préparés et ajoutez suffisamment de PBS pour les immerger. Sous un microscope à dissection, soulevez doucement les bords du tissu avec un pinceau fin et faites le tour de la rétine pour le séparer de la membrane.
Utilisez une pince et le pinceau pour retirer la membrane sous la partie flottante de la rétine. Ensuite, aspirez soigneusement le PBS restant, de sorte que le tissu rétinien repose sur la lame de microscope, côté cellule ganglionnaire vers le bas. Le marquage par immunofluorescence de la synaptophysine sur le dessus de la rétine divisée a indiqué que les terminaisons synaptiques des photorécepteurs étaient conservées.
Cependant, les noyaux des photorécepteurs étaient absents, confirmant la division de la rétine à travers les axones des photorécepteurs. L’intégrité synaptique a été évaluée par marquage de RGS11 dans les dendrites ON-BC et de CtBP2 dans les rubans synaptiques des photorécepteurs. La division n’a pas endommagé la morphologie des terminaisons photoréceptrices de la couche plexiforme externe.
La viabilité des globules rouges dans la rétine divisée a été évaluée à l’aide d’un colorant nucléaire proche infrarouge. Une variabilité régionale de la viabilité cellulaire à travers le tissu a été observée avec une mort cellulaire plus élevée dans certaines zones, la plupart des globules rouges restant viables après la division. Le marquage par immunofluorescence des globules rouges contre PKC alpha et des cellules horizontales contre la calbindine-D a montré une diffusion rapide des anticorps dans la rétine divisée après une heure d’incubation.
