Beginnen Sie damit, die Netzhaut der gespaltenen Maus mit den daran befestigten Nitrozellulosemembranen 30 Minuten lang in 4%iges Paraformaldehyd auf Eis zu tauchen. Ersetzen Sie als Nächstes das Paraformaldehyd durch 5 bis 10 Milliliter PBS bei Raumtemperatur, um die gespaltene Netzhaut zu waschen. Bevor Sie die gespaltene Netzhaut von der Nitrozellulose entfernen, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um kreisförmige Vertiefungen auf einem Objektträger vorzubereiten.
Lassen Sie die Mulden 5 bis 10 Minuten an der Luft trocknen. Legen Sie anschließend die gespaltenen Netzhäute in die vorbereiteten Vertiefungen und fügen Sie genügend PBS hinzu, um sie einzutauchen. Heben Sie unter einem Präpariermikroskop die Ränder des Gewebes vorsichtig mit einem feinen Pinsel an und kreisen Sie um die Netzhaut, um sie von der Membran zu trennen.
Verwende eine Pinzette und den Pinsel, um die Membran unter dem schwimmenden Teil der Netzhaut zu entfernen. Anschließend das restliche PBS vorsichtig absaugen, so dass das Netzhautgewebe mit der Zellseite nach unten auf dem Objektträger aufliegt. Die Immunfluoreszenzmarkierung von Synaptophysin auf der Oberseite der gespaltenen Netzhaut zeigte, dass die synaptischen Endigungen der Photorezeptoren erhalten blieben.
Es fehlten jedoch Photorezeptorkerne, was bestätigte, dass sich die Netzhaut durch die Photorezeptoraxone gespalten hatte. Die synaptische Integrität wurde durch Markierung von RGS11 in ON-BC-Dendriten und CtBP2 in synaptischen Photorezeptorbändern untersucht. Die Spaltung beschädigte die Morphologie der Photorezeptorendigungen in der äußeren plexiformen Schicht nicht.
Die Lebensfähigkeit der Erythrozyten in der gespaltenen Netzhaut wurde mit einem Nahinfrarot-Kernfarbstoff untersucht. Regionale Variabilität der Zelllebensfähigkeit im gesamten Gewebe wurde mit einem höheren Zelltod in einigen Bereichen beobachtet, wobei die meisten Erythrozyten nach der Teilung lebensfähig blieben. Die Immunfluoreszenzmarkierung von Erythrozyten gegen PKC alpha und horizontalen Zellen gegen Calbindin-D zeigte eine schnelle Antikörperdiffusion in der gespaltenen Netzhaut nach einer Stunde Inkubation.