Börja med att sänka ner den delade musnäthinnan med fastsatta nitrocellulosamembran i 4% paraformaldehyd på is i 30 minuter. Byt sedan ut paraformaldehyden mot 5 till 10 milliliter rumstempererad PBS för att tvätta de delade näthinnorna. Innan du tar bort den delade näthinnan från nitrocellulosan, använd en hydrofob barriärpenna för att förbereda cirkulära brunnar på ett objektglas.
Låt brunnarna lufttorka i 5 till 10 minuter. Placera sedan de delade näthinnorna i de förberedda brunnarna och tillsätt tillräckligt med PBS för att sänka ner dem. Under ett dissektionsmikroskop lyfter du försiktigt kanterna på vävnaden med en fin pensel och cirklar runt näthinnan för att separera den från membranet.
Använd en pincett och penseln för att ta bort membranet under den flytande delen av näthinnan. Aspirera sedan försiktigt bort den återstående PBS:en, så att näthinnevävnaden vilar på mikroskopets glidsida med gangliecellsidan nedåt. Immunofluorescensmärkning av synaptophysin över toppen av den delade näthinnan indikerade att fotoreceptorns synaptiska terminaler bibehölls.
Fotoreceptorkärnor saknades dock, vilket bekräftar att näthinnan delade sig genom fotoreceptoraxonerna. Synaptisk integritet bedömdes genom märkning av RGS11 i ON-BC-dendriter och CtBP2 i fotoreceptorsynaptiska band. Spaltningen skadade inte morfologin hos fotoreceptorterminalerna i det yttre plexiforma skiktet.
RBC:s viabilitet i den delade näthinnan bedömdes med hjälp av ett nära infrarött kärnfärgämne. Regional variabilitet i cellviabilitet över vävnaden observerades med högre celldöd i vissa områden, där de flesta röda blodkroppar förblev livskraftiga efter delning. Immunofluorescensmärkning av röda blodkroppar mot PKC alfa och horisontella celler mot Calbindin-D visade snabb antikroppsdiffusion i den delade näthinnan efter en timmes inkubation.
