preparing vascular cells for in vivo matrix gel plug assay

Vereinfachung von Angiogenese-Studien mit einem modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Angiogenese und Gefäßpermeabilität durch einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Our research deals with angiogenesis, the process of formation of new vessels from preexisting vessels. It plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development or curing atherosclerosis, tumor development, etc. The construction of a reliable model to evaluate the extent of angiogenesis is critical for myocardial research or the discovery of medicines for angiogenesis-depend diseases.However, most of the existing models are complex, expensive, and require specialized equipment. Here, we present a modified matrix gel plug assay that can be used to investigate angiogenesis and vessel permeability without staining in a simple, more intuitive, as well as efficient manner.

Vorbereitung von Gefäßzellen für den In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des vollständigen Endothelkulturmediums mit 460 Millilitern Endothelzellmedium und fügen Sie 50 Milliliter FBS, fünf Milliliter Penicillin-Streptomycin und fünf Milliliter Endothelzellwachstumsergänzung hinzu. Die vorbereiteten Medien können einen Monat lang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Als nächstes werden in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit 0,1 Millionen Gefäßzellen bei acht Millilitern des vorbereiteten vollständigen Endothelkulturmediums die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert, bis 70 % Kofluenz erreicht sind.Nehmen Sie dann das Kulturmedium aus der Schale und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um nicht angeschlossene Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Nach dem Entfernen des PBS drei Milliliter 0,25%iges Trypsin mit 2,21 Millimolar EDTA zu den Zellen geben und die Schale eine Minute lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung.Neutralisieren Sie das Trypsin mit sieben Millilitern vollständigem endothelialem Kulturmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig von der Kulturschale ab. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, nachdem Sie sie 10 Minuten lang in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 400 g gesammelt haben. Nach dem Entfernen des Überstands werden die Zellen in fünf Millilitern vollständigem endothelialem Kulturmedium erneut suspendiert, dann die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und ein berechnetes Suspensionsvolumen mit 2 Millionen Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt.Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 400 g zentrifugieren, bevor Sie den Überstand entfernen. Die Gefäßzellen sind nun bereit für das Mischen mit dem Matrixgel für den Matrix-Gel-Plug-Assay.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Forschung

Biologie

Preparing Matrix Gel with Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

Vorbereitung von Matrix-Gel mit Gefäßzellen für den In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay

Matrix Gel Mixture Injection into Mouse for Matrix Gel Plug Assay

Injektion einer Matrix-Gel-Mischung in die Maus für den Matrix-Gel-Plug-Assay

Dextran-FITC Injection and Matrix Gel Plug Collection from Mouse for Matrix Gel Plug Assay

Dextran-FITC-Injektion und Matrix-Gel-Plug-Entnahme aus der Maus für den Matrix-Gel-Plug-Assay