Начните с инкубации скелетных мышечных волокон крысы с TMRE при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем запустите стандартное программное обеспечение конфокального микроскопа и выберите конфигурационную рамку. В диалоговом окне «Конфигурация оборудования» выберите «Лазер» и установите флажок «Гелий Неон 543».
Откройте диалоговое окно получения с помощью платформы Acquire и выберите панель XYZ. Затем выберите формат 512x512 с частотой 400 герц. Под отображаемой панелью «Отверстие» выберите произвольные единицы измерения и введите три области для отверстия.
В диалоговом окне настроек Bean Path выберите объектив с 20-кратным увеличением погружения в воду с числовой апертурой 0,7 и длиной волны излучения от 576 до 700 нанометров. Выберите DD 488543 и установите мощность лазера 543 на 15%После 20-минутной инкубации дважды смените среду для инкубации. Далее подготовьте записывающую камеру с помощью защитного стекла из боросиликатного стекла толщиной 0,15 миллиметра.
Переложите пучки волокон в камеру, содержащую 200 микролитров расслабленного раствора. Используйте режим яркого поля конфокального микроскопа для определения жизнеспособных волокон для флуоресцентной регистрации митохондрий. Регулируйте, усиливайте и смещайте путем сканирования флуоресценции с помощью кнопки «Трансляция».
Выберите низкие значения интенсивности флуоресценции для фона, близкого к нулю произвольных единиц, и митохондриального сигнала в диапазоне от 100 до 200 произвольных единиц. Выберите размер пикселя от 150 до 190 нанометров и отрегулируйте коэффициент масштабирования в диалоговом окне XY, чтобы получить полную ширину волокна. В диалоговом окне Стек Z задайте расстояние Z, начиная с глубины волокна от 15 микрометров до 22 микрометров, и выберите размер шага Z, равный 3 микрометрам.
Нажмите кнопку Пуск, чтобы получить конфокальные изображения и получить стек Z, состоящий из трех конфокальных изображений, полученных на глубине 15, 18 и 21 микрометр. Конфокальные изображения мышечного волокна с физической нагрузкой показывают ожидаемую запись митохондрий скелетных мышечных волокон с постоянным рисунком волокон. Напротив, мышечные волокна крыс с ожирением демонстрируют существенные изменения в составе и распределении митохондрий.