Name: Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) Enrichment from Human Faeces Using Differential Centrifugation Speeds
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Extracellular Vesicles BEVs Enrichment from Human Faeces Using Differential Centrifugation Speeds at JoVE.com

bacterial extracellular vesicles (bevs) enrichment from human faeces using differential centrifugation speeds

בידוד משופר של בועיות חוץ-תאיות חיידקיות עבור מיקרוביוטה רב-אומית

The gut is widely recognized as the organ harboring the most abundant microbial communities in the human body, with over 90% of bacteria involved in colonization and multiplication1,2. Extensive evidence has demonstrated that the gut microbiota modulates the gut microenvironment and simultaneously interacts with dysfunction in distant organs, primarily through an impaired intestinal barrier3,4. Mounting evidence indicates a correlation between the imbalance of gut microbiota and the progression of inflammatory bowel disease (IBD)5,6, as well as cognitive disorders through the gut-brain axis5,6,7,8. Bacterial extracellular vesicles (BEVs) produced by bacteria play significant roles in these pathological processes.
BEVs are nanoscale particles encapsulating bacterial derivatives, with diameters ranging from 20 to 400 nm. They have been demonstrated to facilitate interactions between bacteria and their host organisms9,10. Despite their invisibility, these particles have garnered increasing attention from researchers due to their prospective broad applications as diagnostic biomarkers, therapeutic targets, and drug delivery vehicles11. Human feces, often used as biospecimens for studying BEVs, predominantly sourced from gut bacteria, contain a complex mixture of water, bacteria, lipids, proteins, undigested food residue, and exfoliated epithelial cells among others. The intricate fecal composition poses challenges to the isolation and purity of BEVs, thereby impeding a comprehensive, objective, and realistic analysis of BEVs. Hence, effective strategies to minimize interference from contaminating components and enhance the yield of BEVs have emerged as critical issues warranting immediate attention.
Existing isolation strategies largely rely on techniques such as ultra-high-speed centrifugation (UC), density gradient centrifugation (DGC), and size exclusion chromatography (SEC)12,13,14,15,16,17. Currently, DGC is one of the most widely applied methods in the field of BEV separation, encompassing two sedimentation-floating modes, &#34;Top-down&#34; and &#34;Bottom-up&#34;, which are determined by the initial loading position of the sample. These methodologies differentiate extracellular vesicles (EVs) from other components based on size and density disparities, yielding variable purity and recovery rates. Prior research has indicated that single-approach strategies are insufficient for adequately separating EVs from soluble proteins in body fluid samples, such as lipoprotein in blood18 and Tamm-Horsfall protein in urine19. Additionally, the size distribution of eukaryotic extracellular vesicles (EEVs) often overlaps with that of BEVs, thereby necessitating further methodological enhancements to optimize BEV yield. Consequently, advancing the study of BEVs hinges on the development of effective separation and purification methodologies. Notably, Tulkens et al15 employed an orthogonal biophysical strategy to separate fecal BEVs from EEVs, in which the centrifugation time of a Bottom-up DGC mode was up to 18 h. In contrast, this study reduced it to 7 h, greatly saving the gradient-ultracentrifugation time and simplifying the process.
In the present study, we isolated and purified fecal BEVs employing two DGC modes under optimized buffer conditions, after enriching BEVs with a range of differential centrifugation speeds, from low to extremely high velocity. Evaluations based on morphology, particle size, and concentration indicated a commendable performance by this enhanced method. This study could serve as the foundation for future research, extending its applications to a broader domain, and offering insights into the heterogeneity of BEVs within the human body. It also contributes to the standardization of BEV separation and analysis techniques.

מחבר זרקור: האצת המחקר על הפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות והטרוגניות 

בידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות

Our study isolates, purifies, and characterize bacterial extracellular vesicles from physicists using density gradient centrifugation. We aim to address the separation of BEVs from contaminants and provide a reliable method for researchers. Our protocol reduces centrifugation time from 18 to 7 hours.Top down mode improves BEV separation and reduces contamination from liver proteins. Our method simplifies the separation of BEVs, setting a standard for future studies. It can be applied to other body fluids with appropriate modification, enhancing our understanding and facilitating the study of BEVs revealing their inherent heterogeneity within the human body.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Extracellular Vesicles BEVs Enrichment from Human Faeces Using Differential Centrifugation Speeds at JoVE.com

Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) Enrichment from Human Faeces Using Differential Centrifugation Speeds  

העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) מצואת אדם באמצעות מהירויות צנטריפוגות דיפרנציאליות

כדי להתחיל, לקחת את דגימות צואה אנושית מוכן. מצננים את צנטריפוגת הקירור במהירות גבוהה ל-4 מעלות צלזיוס. השתמש PBS כדי להתאים את המשקל של צינורות הדגימה ל 0.1 גרם, וצנטריפוגה אותם ב 3, 000 גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.בעזרת פיפטה מפלסטיק, מעבירים את הסופרנאטנט לשני צינורות 50 מיליליטר, ומשאירים מאחור מיליליטר אחד. לאחר מכן, צנטריפוגה את supernatant ב 12, 000 גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעזרת מזרק 20 מיליליטר שואפים את הסופרנטנט ומוציאים את המחט מהמזרק.סנן את הנוזל דרך מסננים 0.22 מיקרומטר לתוך צינורות 50 מיליליטר. לאחר מכן, נגבו את הדלי עם 75% אלכוהול כדי למנוע את הזיהום שנותר. מעבירים כ-30 מיליליטר של הסופרנאטנט הצואתי המסונן לצינור האולטרה-צנטריפוגה.מלאו את הצינור בכ-8 מיליליטר PBS, תוך השארת רווח של 3 מילימטר מפתח הצינור. הניחו את שני צינורות האולטרה-צנטריפוגות בדליים אולטרה-צנטריפוגות מנוגדות, והשוו את משקל שני הדליים באמצעות PBS. טען את כל הדליים על הרוטור, ללא קשר אם הם עמוסים בצינורות.מניחים את הדגימות בצנטריפוגה, יוזמים את הוואקום ומסובבים אותם ב 160, 000 גרם במשך 70 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. ברגע שהצנטריפוגה הושלמה, שחררו את הוואקום התא ופתחו את דלת הצנטריפוגה האולטרה. לאחר מכן, הסר מיד את הרוטור.מעבירים את הדליים מהרוטור למתלה, ומרימים את הצינורות באמצעות פטם. השליכו את הסופרנטנט, ושמרו את הכדורים החומים הנראים לעין. הוסף 1 מיליליטר של PBS מקורר מראש כדי להשהות מחדש את הכדוריות לחלוטין.ממלאים את הצינור בכ-37 מיליליטר PBS, ומשאירים מרווח של 3 מילימטר מהפתח. לאחר ביצוע סיבוב נוסף של אולטרה-צנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט והשאירו את הצינור הפוך למשך 5 דקות. הסר כל פתרון שנותר על הקיר הפנימי עם מגבים.באמצעות פיפטה 1, 000 מיקרוליטר, להוסיף 1.2 מיליליטר של PBS מצונן מראש כדי להשהות מחדש כדורים, ולערבב אותם על ידי pipetting. העבר 1.2 מיליליטר של פתרון PBS BEV מצינור אולטרה-צנטריפוגה אחד למיקרו-צינור נקי של 1.5 מיליליטר.