Name: Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) from Human Faeces
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles BEVs from Human Faeces at JoVE.com

establishment of a density gradient centrifugation system to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (bevs) from human faeces

تعزيز عزل الحويصلات البكتيرية خارج الخلية للميكروبات متعددة الأوميكس

The gut is widely recognized as the organ harboring the most abundant microbial communities in the human body, with over 90% of bacteria involved in colonization and multiplication1,2. Extensive evidence has demonstrated that the gut microbiota modulates the gut microenvironment and simultaneously interacts with dysfunction in distant organs, primarily through an impaired intestinal barrier3,4. Mounting evidence indicates a correlation between the imbalance of gut microbiota and the progression of inflammatory bowel disease (IBD)5,6, as well as cognitive disorders through the gut-brain axis5,6,7,8. Bacterial extracellular vesicles (BEVs) produced by bacteria play significant roles in these pathological processes.
BEVs are nanoscale particles encapsulating bacterial derivatives, with diameters ranging from 20 to 400 nm. They have been demonstrated to facilitate interactions between bacteria and their host organisms9,10. Despite their invisibility, these particles have garnered increasing attention from researchers due to their prospective broad applications as diagnostic biomarkers, therapeutic targets, and drug delivery vehicles11. Human feces, often used as biospecimens for studying BEVs, predominantly sourced from gut bacteria, contain a complex mixture of water, bacteria, lipids, proteins, undigested food residue, and exfoliated epithelial cells among others. The intricate fecal composition poses challenges to the isolation and purity of BEVs, thereby impeding a comprehensive, objective, and realistic analysis of BEVs. Hence, effective strategies to minimize interference from contaminating components and enhance the yield of BEVs have emerged as critical issues warranting immediate attention.
Existing isolation strategies largely rely on techniques such as ultra-high-speed centrifugation (UC), density gradient centrifugation (DGC), and size exclusion chromatography (SEC)12,13,14,15,16,17. Currently, DGC is one of the most widely applied methods in the field of BEV separation, encompassing two sedimentation-floating modes, &#34;Top-down&#34; and &#34;Bottom-up&#34;, which are determined by the initial loading position of the sample. These methodologies differentiate extracellular vesicles (EVs) from other components based on size and density disparities, yielding variable purity and recovery rates. Prior research has indicated that single-approach strategies are insufficient for adequately separating EVs from soluble proteins in body fluid samples, such as lipoprotein in blood18 and Tamm-Horsfall protein in urine19. Additionally, the size distribution of eukaryotic extracellular vesicles (EEVs) often overlaps with that of BEVs, thereby necessitating further methodological enhancements to optimize BEV yield. Consequently, advancing the study of BEVs hinges on the development of effective separation and purification methodologies. Notably, Tulkens et al15 employed an orthogonal biophysical strategy to separate fecal BEVs from EEVs, in which the centrifugation time of a Bottom-up DGC mode was up to 18 h. In contrast, this study reduced it to 7 h, greatly saving the gradient-ultracentrifugation time and simplifying the process.
In the present study, we isolated and purified fecal BEVs employing two DGC modes under optimized buffer conditions, after enriching BEVs with a range of differential centrifugation speeds, from low to extremely high velocity. Evaluations based on morphology, particle size, and concentration indicated a commendable performance by this enhanced method. This study could serve as the foundation for future research, extending its applications to a broader domain, and offering insights into the heterogeneity of BEVs within the human body. It also contributes to the standardization of BEV separation and analysis techniques.

تسليط الضوء على المؤلف: تسريع البحث حول فصل الحويصلات البكتيرية خارج الخلية وعدم التجانس 

عزل وتنقية الحويصلات البكتيرية خارج الخلية من البراز البشري باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة

Our study isolates, purifies, and characterize bacterial extracellular vesicles from physicists using density gradient centrifugation. We aim to address the separation of BEVs from contaminants and provide a reliable method for researchers. Our protocol reduces centrifugation time from 18 to 7 hours.Top down mode improves BEV separation and reduces contamination from liver proteins. Our method simplifies the separation of BEVs, setting a standard for future studies. It can be applied to other body fluids with appropriate modification, enhancing our understanding and facilitating the study of BEVs revealing their inherent heterogeneity within the human body.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles BEVs from Human Faeces at JoVE.com

Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) from Human Faeces  

إنشاء نظام طرد مركزي متدرج الكثافة لعزل وتنقية الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) من البراز البشري

للبدء ، خذ 500 ميكرولتر من محلول PBS / BEV المحضر. امزجه مع ثلاثة ملليلتر من PBS واخلطه برفق باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر. ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 31 ملليلتر على صفيحة رغوية بها ثقوب ، وقم بتسمية الأنبوب بسهم لأسفل.ثم أمسك ماصة 1،000 ميكرولتر عموديا وأضف ثلاثة ملليلتر من محلول اليوديكسانول 50٪ إلى قاع الأنبوب. ضع حامل أنبوب أعلى قليلا من مستوى لوحة الرغوة أسفل فتحة الأنبوب ، وقم بإمالة الأنبوب بزاوية 70 درجة. باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول اليوديكسانول 40٪ فوق محلول اليوديكسانول 50٪.ثم ضع ثلاثة ملليلتر من محلول اليوديكسانول 20٪ على محلول اليوديكسانول 40٪. باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول يوديكسانول 10٪ فوق محلول اليوديكسانول المحضر بنسبة 20٪. بعد ذلك ، أضف 3.5 ملليلتر من محلول PBS / BEV فوق محلول اليوديكسانول 10٪ ، وأعد الأنابيب برفق إلى وضع رأسي.الآن ، ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 31 ملليلتر على صفيحة رغوية بها ثقوب ، وقم بتسميته بسهم تصاعدي. باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، أضف عموديا 2.5 ملليلتر من محلول مخزون اليوديكسانول 60٪ في قاع الأنبوب ، وادمجه مع 500 ميكرولتر من محلول PBS / BEV للحصول على ثلاثة ملليلتر من محلول 50٪ iodixanol BEV. امزج المحلول جيدا عن طريق الماصة.ثم بعد وضع طبقات من محلول اليوديكسانول 40 و 20 و 10٪ بالتسلسل ، استخدم ماصة 1،000 ميكرولتر لإضافة 3.5 ملليلتر من PBS فوق محلول اليوديكسانول 10٪. اضبط وزن الأنبوبين باستخدام PBS على الوزن الإجمالي في حدود زائد ناقص 0.005 جرام. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في الدلاء وأجهزة الطرد المركزي عند 160،000 جم لمدة سبع ساعات عند أربع درجات مئوية.باستخدام جهاز سحب ، اجمع الكسور التي تم الحصول عليها من وضع الطرد المركزي الفائق المتدرج بالتتابع من أعلى إلى أسفل مقابل الجدار الجانبي في 10 أنابيب منفصلة للطرد المركزي الفائق سعة 38.5 ملليلتر. ثم أجهزة الطرد المركزي الفائقة الكسور عند 160،000 غرام لمدة 70 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، واقلب أنابيب الطرد المركزي الفائقة لمدة خمس دقائق.بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS المبرد مسبقا باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. انقل محلول PBS / BEV إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر. قم بتسمية الكسور من F1 إلى F10 كما تم الحصول عليها من وضع الطرد المركزي الفائق المتدرج ، وتابع التحليل.