Name: Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) from Human Faeces
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles BEVs from Human Faeces at JoVE.com

establishment of a density gradient centrifugation system to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (bevs) from human faeces

Förbättrad isolering av bakteriella extracellulära vesiklar för Microbiota Multi-Omics

The gut is widely recognized as the organ harboring the most abundant microbial communities in the human body, with over 90% of bacteria involved in colonization and multiplication1,2. Extensive evidence has demonstrated that the gut microbiota modulates the gut microenvironment and simultaneously interacts with dysfunction in distant organs, primarily through an impaired intestinal barrier3,4. Mounting evidence indicates a correlation between the imbalance of gut microbiota and the progression of inflammatory bowel disease (IBD)5,6, as well as cognitive disorders through the gut-brain axis5,6,7,8. Bacterial extracellular vesicles (BEVs) produced by bacteria play significant roles in these pathological processes.
BEVs are nanoscale particles encapsulating bacterial derivatives, with diameters ranging from 20 to 400 nm. They have been demonstrated to facilitate interactions between bacteria and their host organisms9,10. Despite their invisibility, these particles have garnered increasing attention from researchers due to their prospective broad applications as diagnostic biomarkers, therapeutic targets, and drug delivery vehicles11. Human feces, often used as biospecimens for studying BEVs, predominantly sourced from gut bacteria, contain a complex mixture of water, bacteria, lipids, proteins, undigested food residue, and exfoliated epithelial cells among others. The intricate fecal composition poses challenges to the isolation and purity of BEVs, thereby impeding a comprehensive, objective, and realistic analysis of BEVs. Hence, effective strategies to minimize interference from contaminating components and enhance the yield of BEVs have emerged as critical issues warranting immediate attention.
Existing isolation strategies largely rely on techniques such as ultra-high-speed centrifugation (UC), density gradient centrifugation (DGC), and size exclusion chromatography (SEC)12,13,14,15,16,17. Currently, DGC is one of the most widely applied methods in the field of BEV separation, encompassing two sedimentation-floating modes, &#34;Top-down&#34; and &#34;Bottom-up&#34;, which are determined by the initial loading position of the sample. These methodologies differentiate extracellular vesicles (EVs) from other components based on size and density disparities, yielding variable purity and recovery rates. Prior research has indicated that single-approach strategies are insufficient for adequately separating EVs from soluble proteins in body fluid samples, such as lipoprotein in blood18 and Tamm-Horsfall protein in urine19. Additionally, the size distribution of eukaryotic extracellular vesicles (EEVs) often overlaps with that of BEVs, thereby necessitating further methodological enhancements to optimize BEV yield. Consequently, advancing the study of BEVs hinges on the development of effective separation and purification methodologies. Notably, Tulkens et al15 employed an orthogonal biophysical strategy to separate fecal BEVs from EEVs, in which the centrifugation time of a Bottom-up DGC mode was up to 18 h. In contrast, this study reduced it to 7 h, greatly saving the gradient-ultracentrifugation time and simplifying the process.
In the present study, we isolated and purified fecal BEVs employing two DGC modes under optimized buffer conditions, after enriching BEVs with a range of differential centrifugation speeds, from low to extremely high velocity. Evaluations based on morphology, particle size, and concentration indicated a commendable performance by this enhanced method. This study could serve as the foundation for future research, extending its applications to a broader domain, and offering insights into the heterogeneity of BEVs within the human body. It also contributes to the standardization of BEV separation and analysis techniques.

Författare i fokus: Accelererande forskning om bakteriell extracellulära vesiklar separation och heterogenitet 

Isolering och rening av bakteriella extracellulära vesiklar från mänsklig avföring med hjälp av densitetsgradientcentrifugering

Our study isolates, purifies, and characterize bacterial extracellular vesicles from physicists using density gradient centrifugation. We aim to address the separation of BEVs from contaminants and provide a reliable method for researchers. Our protocol reduces centrifugation time from 18 to 7 hours.Top down mode improves BEV separation and reduces contamination from liver proteins. Our method simplifies the separation of BEVs, setting a standard for future studies. It can be applied to other body fluids with appropriate modification, enhancing our understanding and facilitating the study of BEVs revealing their inherent heterogeneity within the human body.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles BEVs from Human Faeces at JoVE.com

Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) from Human Faeces  

Etablering av ett gradientcentrifugeringssystem för att isolera och rena bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) från mänsklig avföring

Börja med att ta 500 mikroliter av den beredda PBS/BEV-lösningen. Kombinera den med tre milliliter PBS och blanda försiktigt med en 1 000 mikroliters pipett. Placera ett 31 ml ultracentrifugrör på en skumplatta med hål och märk röret med en nedåtpil.Håll sedan en 1 000 mikroliters pipett vertikalt och tillsätt tre milliliter av 50 % jodixanollösningen i botten av röret. Placera en rörhållare något ovanför skumplattans nivå under röröppningen och luta röret till en vinkel på 70 grader. Använd en 1 000 mikroliters pipett och tillsätt tre milliliter 40 % jodixanollösning ovanpå 50 % jodixanollösningen.Lägg sedan tre milliliter 20 % jodixanollösning på 40 % jodixanollösningen. Använd en 1 000 mikroliters pipett och tillsätt tre milliliter av en 10 % jodixanollösning ovanpå den beredda 20 % jodixanollösningen. Tillsätt sedan 3.5 milliliter PBS/BEV-lösningen ovanpå 10 % jodixanollösningen och sätt försiktigt tillbaka rören till upprätt läge.Placera nu ett 31 milliliter ultracentrifugrör på en skumplatta med hål och märk det med en uppåtpil. Använd en 1 000 mikroliters pipett, tillsätt vertikalt 2,5 milliliter av 60 % jodixanolstamlösningen i botten av röret och kombinera den med 500 mikroliter PBS/BEV-lösning för att få tre milliliter 50 % jodixanol BEV-lösning. Blanda lösningen noggrant genom pipettering.Efter skiktning av 40, 20 och 10 % jodixanollösning i följd, använd sedan en 1 000 mikroliters pipett för att tillsätta 3,5 milliliter PBS ovanpå 10 % jodixanollösningen. Justera vikten på de två rören med PBS till en totalvikt inom plus minus 0,005 gram. Placera sedan rören i hinkarna och centrifugera dem vid 160 000 G i sju timmar vid fyra grader Celsius.Använd en pipetter och samla upp fraktionerna från ett gradientultracentrifugeringsläge sekventiellt uppifrån och ned mot sidoväggen i 10 separata 38,5 ml ultracentrifugrör. Ultracentrifugera sedan fraktionerna vid 160 000 G i 70 minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och vänd upp och ner på ultracentrifugrören i fem minuter.Återsuspendera sedan pelletsen i 200 mikroliter förkyld PBS med en 200 mikroliters pipett. Överför PBS/BEV-lösningen till ett rent 1.5 ml mikrorör. Märk fraktionerna från F1 till F10 som erhållna från en gradientultracentrifugeringsmetod och fortsätt för analys.