Name: Isolation and Digestion of Mouse Carotid Artery for Single-Cell Suspension Preparation
Uploaded: 2024-01-19T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Digestion of Mouse Carotid Artery for Single-Cell Suspension Preparation at JoVE.com

isolation and digestion of mouse carotid artery for single-cell suspension preparation

هضم الخلايا من خطوتين للشريان السباتي للفأر

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

تسليط الضوء على المؤلف: تفكك أنسجة الأوعية الدموية واستكشاف المجموعات الفرعية أحادية الخلية للعلاج الموجه 

تحضير معلق أحادي الخلية من الشرايين السباتية للفأر لتسلسل الخلية الواحدة

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Digestion of Mouse Carotid Artery for Single-Cell Suspension Preparation at JoVE.com

Isolation and Digestion of Mouse Carotid Artery for Single-Cell Suspension Preparation  

عزل وهضم الشريان السباتي للفأر لإعداد تعليق خلية واحدة

للبدء ، رش الماوس القتل الرحيم بنسبة 75٪كحول. ثم قمت بتعقيم مقص التشريح لفتح الجلد وفضح تجويف الصدر. اقطع الحجاب الحاجز ، ثم استمر في القطع لأعلى باتجاه الفك السفلي وقم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون التي تعرض الشريان السباتي بعناية.بعد ذلك ، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي لجعل الدم يتدفق من الدورة الدموية المغلقة. باستخدام حقنة حقن ببطء 20 ملليلتر من محلول التروية المبردة مسبقا في البطين الأيسر. ضع الماوس تحت المجهر المجسم.ثم باستخدام مقص تشريح دقيق ، انزع الدهون والأنسجة الضامة حول الشريان السباتي. عزل الشريان السباتي وغسله مع برنامج تلفزيوني لطرد أي دم متبقي. نقل الشريان إلى صفيحة ستة آبار تحتوي على 1.5٪ FBS على الجليد.باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بتشريح الشريان السباتي طوليا ووضعه بشكل مسطح في صفيحة جديدة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر واحد من FBS على الجليد. اغسل بطانة الشريان بعناية باستخدام FBS لإزالة الدم المتبقي. قطع الشريان إلى قطعتين من الأنسجة المربعة ملليمتر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإغراق الأنسجة في القاع. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 500 ميكرولتر من كاشف التفكك أ- ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع ماصة واحدة برفق باستخدام ماصة ملليلتر واحدة كل 10 دقائق. ثم أضف 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في الأنبوب واخلطه جيدا.قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرون في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم قم بطرد الراشح وإزالة المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من كاشف التفكك ب- ضع الأنبوب في حمام مائي لفصل الخلايا تماما إلى تعليق خلية واحدة. بعد خمس دقائق ، أضف 200 ميكرولتر من 5٪ FBS لإنهاء تفاعل الهضم ، والطرد المركزي للتعليق ، وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS على الجليد.أظهرت الملاحظات المجهرية أن الجمع بين كاشف التفكك B والكاشف A أدى إلى تفكك أكثر شمولا لأنسجة الشريان السباتي مقارنة باستخدام كاشف التفكك A وحده. تم جمع ما مجموعه 176،000 خلية مفردة من تسعة سباتي يسار مع فصل معظم الأوعية الدموية بنجاح إلى خلايا مفردة ذات قدرة عالية على البقاء. بعد عملية الهضم غير الخاضعة للإشراف ، كشف التجمع القائم على SIRAH عن أربعة أنواع رئيسية من الخلايا في الشرايين السباتية الطبيعية للفئران.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Digestion of Mouse Carotid Artery for Single-Cell Suspension Preparation

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...