Para empezar, rocía al ratón sacrificado con alcohol al 75%. A continuación, esterilizó unas tijeras de disección para abrir la piel y exponer la cavidad torácica. Corte el diafragma, luego continúe cortando hacia arriba hacia la mandíbula inferior y retire con cuidado el exceso de tejido conectivo y grasa que expone la arteria carótida.
A continuación, corte la vena cava inferior para que la sangre fluya fuera de la circulación cerrada. Con una jeringa, inyecte lentamente 20 mililitros de solución de perfusión preenfriada en el ventrículo izquierdo. Coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico.
Luego, con unas tijeras de microdisección, retire la grasa y los tejidos conectivos alrededor de la arteria carótida. Aísle la arteria carótida y lávela con PBS para eliminar cualquier resto de sangre. Transfiera la arteria a una placa de seis pocillos que contenga 1,5% de FBS en hielo.
Con unas tijeras de microdisección, diseccione la arteria carótida longitudinalmente y colóquela plana en una nueva placa de seis pocillos que contenga un mililitro de FBS en hielo. Enjuague cuidadosamente la íntima de la arteria con FBS para eliminar la sangre residual. Corta la arteria en trozos cuadrados de tejido de dos milímetros y transfiérelos a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar a 400 G durante 5 minutos a 4 grados centígrados para hundir los tejidos hasta el fondo. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los tejidos en 500 microlitros de reactivo de disociación A. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora, pipeteando suavemente con una pipeta de un mililitro cada 10 minutos. Luego agregue 500 microlitros de 5% FBS en el tubo y mezcle bien.
Filtre la suspensión celular a través de un colador celular estéril de 40 micras en un tubo de 1,5 mililitros. Luego centrifugue el filtrado y elimine el sobrenadante antes de volver a suspender el gránulo en 200 microlitros de reactivo de disociación B. Coloque el tubo en un baño de agua para disociar completamente las células en una suspensión de una sola célula. Después de cinco minutos, agregue 200 microlitros de 5% de FBS para terminar la reacción de digestión, centrifugue la suspensión y deseche el sobrenadante antes de volver a suspender el gránulo en 100 microlitros de PBS en hielo.
Las observaciones microscópicas mostraron que la combinación del reactivo de disociación B con el reactivo A condujo a una disociación más completa del tejido de la arteria carótida en comparación con el uso del reactivo de disociación A solo. Se recogieron un total de 176.000 células individuales de nueve carótidas izquierdas, y la mayoría de los vasos vasculares se disociaron con éxito en células individuales con alta viabilidad. Después de la digestión, el agrupamiento no supervisado basado en SIRAH reveló cuatro tipos principales de células en las arterias carótidas normales de ratón.