Name: Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging
Uploaded: 2023-08-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging at JoVE.com

labeling and staining rat brain pericytes for fluorescent imaging

הדמיה של התכווצות פריציטים במוח לאחר דימום subarachnoid

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

מחבר זרקור: הדמיה Pericytes לאחר דימום subarachnoid במכרסמים 

הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging at JoVE.com

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging  

תיוג והכתמה של פריציטים במוח של חולדות לצורך הדמיה פלואורסצנטית

כדי לתייג את הפריציטים, הוסף את הצבע הפלואורסצנטי TO-PRO-3 לנוזל השדרה המוחי המלאכותי או ACSF. כעת דגרו על מוח החולדה שזה עתה נחתך ב-ACSF עמוס הצבעים למשך 20 דקות בסביבה חשוכה ובטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להעביר את מסננת רשת ניילון עם פרוסות המוח לתא שטיפה צלחת שש בארות.תן את פרוסות המוח לנוח בחדר במשך 10 דקות. כדי לתייג את הפריציטים שאינם חיוניים, דגרו על פרוסות המוח המתויגות TO-PRO-3 באיזולקטין B4 מצומד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, שטפו את פרוסות המוח בנוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה במשך 15 דקות.לאחר מכן, הניחו את פרוסות המוח בגז ACSF עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% חמצן. לשם כך, להוסיף יודיד פרופידיום בריכוז של 37 micromolar ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את ספיגת הצבע ולמזער את תיוג הרקע, שטפו את התכשירים במשך 15 דקות ב-ACSF.בתנאים פיזיולוגיים רגילים, פריציטים במוח אינם חווים מוות תאי. זוהו פריציטים ברי קיימא שלא הוכתמו בפרופידיום יודיד. מודלים SAH צריך pericytes חיוני בתוך microvasculature.כמו כן התגלו פריציטים לא חיוניים. פרופידיום יודיד מסומן פריציטים לא חיוניים נשאר מחובר microvasculature כולו.

Research