Para empezar, inyecte al ratón vectores asociados a AAV en el cerebro del ratón. Después de tres o cuatro semanas de la inyección del virus, afeite las áreas ventral y posterior del cuello de un ratón anestesiado. Limpie las áreas afeitadas con tres exfoliantes de yodo en rotación con una solución de etanol al 70%.
Haga una incisión ventral en la piel entre los omóplatos. Después, coloque una gasa quirúrgica sobre la incisión y coloque al animal en decúbito supino, con la cabeza mirando hacia el cirujano. Luego haga una pequeña incisión vertical en el lado derecho del cuello, por encima de la clavícula, para exponer la arteria carótida derecha y la vena yugular.
Después de separar el tejido subcutáneo, exponga la vena yugular externa derecha y coloque la sutura debajo de la vena. Amarre el extremo distal de la vena yugular para detener el flujo sanguíneo. Con micropinzas y tijeras, haga una pequeña incisión en la vena colapsada.
Ahora, inserte el catéter venoso con el bisel hacia abajo y muévalo proximalmente hacia la vena cava superior hasta llegar a la aurícula derecha. Con una sutura de seda 7-0, asegure el catéter al vaso. Diseccionar los tejidos conectivos para exponer la arteria carótida común derecha.
Proximalmente, coloque previamente dos asas de sutura de seda 7-0 que permanezcan sueltas al nivel donde se dividen las arterias carótidas interna y externa. Para detener el flujo sanguíneo temporalmente, tire de un asa de sutura previamente colocada. Luego, con unas microtijeras o una aguja de calibre 27, cree una pequeña abertura en la pared del vaso.
Inserte el catéter arterial proximalmente mientras suelta el asa de sutura, y avance el catéter hasta llegar al arco de la aorta, sin tocar la válvula aórtica. Utilice las dos suturas precolocadas para sujetar el catéter al vaso. Tunelice todos los catéteres por vía subcutánea, exteriorícelos en la parte posterior del cuello a través de la incisión precortada y cierre la incisión ventral.
Conecte los catéteres a los puertos venosos o arteriales del conector de tubo recubierto de silicona hecho de tubo de aguja de calibre 25. Después de cerrar la incisión ventral, asegure el conector por vía subcutánea cuando la piel posterior esté sellada con suturas. Con alambres quirúrgicos de acero inoxidable, llene los catéteres con solución salina heparinizada y tape firmemente los extremos de los catéteres.
Para sujetar al animal a un sistema automatizado de extracción de sangre 24 horas después de la cirugía, conecte el gancho de sujeción al anillo de metal en la parte posterior del cuello y conecte la línea arterial. Una vez que el catéter arterial esté conectado a la línea de inyección, conecte los catéteres venosos a las líneas de muestreo. Ajuste el tiempo de inyección y la dosis a 0,5 miligramos por kilogramo a 500 microlitros por minuto.
Ajuste el tiempo y la frecuencia de la toma de muestras de sangre, incluida la dilución de la muestra con solución salina. El sistema repondrá automáticamente una cantidad igual de solución salina para reemplazar la sangre muestreada. Realice la preinyección automatizada.
A continuación, realice una inyección intravenosa automatizada del fármaco N-óxido de clozapina a una velocidad de inyección de 500 microlitros por minuto. A continuación, realice una toma de muestras de sangre posterior a la inyección. Se presentan los patrones de la hormona luteinizante en mujeres adultas con Kiss1-EYFP que recibieron una inyección estereotáxica unilateral de AAV-hM3Dq-mCherry en el núcleo arqueado.
Los niveles de la hormona diestro luteinizante son generalmente bajos, pero generalmente se observan variaciones debido a su liberación pulsátil. Se produce un fuerte aumento en los niveles de la hormona luteinizante en respuesta a la inyección de N-óxido de clozapina. La mayoría de las neuronas mCherry colocalizadas con Kiss1-EYFP demostraron que la activación viral y neuronal es específica de la población objetivo.
Se muestra un patrón pulsátil de liberación de hormona luteinizante en ratones diestros de tipo salvaje, seguido de la respuesta a una inyección IP de Kisspeptina-10. Se observaron pulsos claros de hormona luteinizante, típicos de una mujer en diestro, que mostraban niveles bajos de hormona luteinizante basal. Se detectó un aumento inmediato y robusto de la hormona luteinizante en respuesta a la administración de Kisspeptina.
