Per iniziare, posiziona un colino cellulare da 70 micron sopra una provetta da centrifuga da 50 millilitri e bagnala con PBS. Dopo aver isolato la milza da un topo, per generare una sospensione a singola cellula, far passare la milza attraverso la rete utilizzando il poggiapollice di uno stantuffo da siringa e 30 millilitri di PBS freddo. Centrifugare il filtrato a 300 G per cinque minuti e rimuovere il surnatante.
Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Dopo la lisi, aggiungere 50 millilitri di PBS freddo nella provetta, quindi centrifugare ed eliminare il surnatante prima di risospendere il pellet nel cocktail di anticorpi appena preparato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta FACS da cinque millilitri e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Dopo l'incubazione, aggiungere tre millilitri di PBS freddo nella provetta, quindi centrifugare ed eliminare il surnatante prima di risospendere il pellet in un millilitro di tampone di risospensione FACS freddo. Filtrare le celle attraverso un tubo FACS con tappo filtrante.