Başlamak için, fare kemik iliği, hematopoietik kök ve progenitör hücreleri içeren bir şişe alın. Bir mikropipet kullanarak, peleti bir mililitre ACK parçalama tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika inkübe edin. Yeniden süspanse edilmiş karışımı, önceden ıslatılmış 70 mikrometre hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Ardından, ACK parçalama tamponunu seyreltmek için 10 mililitre FACS tamponu ekleyin. Karışımı 400 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve peleti 10 mililitre FACS tamponunda önce bir mililitre tamponda yeniden süspanse ederek ve ardından dokuz mililitre tamponla doldurarak yeniden süspanse edin. Şimdi, 0,5 mililitrelik bir tüpte 10 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ile 10 mikrolitre hücreyi karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
Hücreleri boyamak için, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. Önce peleti bir mililitre tampon içinde yeniden süspanse ederek ve ardından kalan hacimle doldurarak, mililitrede bir kez 10 ila yedi hücrelik bir nihai konsantrasyon elde etmek için peleti FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Bir P1000 mikropipet kullanarak, süspansiyonu 35 mikrometrelik bir hücre süzgeci kapağından bir FACS tüpüne aktarın.
Ardından, burada gösterildiği gibi boyama karışımını hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra, hücre süspansiyonunu 300 mikrolitre boyamada yeniden süspanse edin, bir numune tüpünde karıştırın ve ışıktan koruyarak 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra numune tüpüne 300 mikrolitre karışım ekleyin ve ışıktan korunan buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
Tek lekeli ve karışık lekeli numune tüplerine üç mililitre FACS tamponu ekleyin. Şimdi hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
500 mikrolitre toplama ortamı ile önceden doldurulmuş 1,5 mililitrelik bir tüp hazırlayın. FACS cihazı kalibre edildikten sonra, hücre süspansiyonuna 500 mikrolitre FACS tamponu ekleyin ve ardından numunenin bir mililitresini 35 mikrometrelik bir hücre süzgeci kapağından yeni bir FACS tüpüne aktarın. Hücre sıralamasından sonra, sıralanan hücrelerin 10 mikrolitresini 90 mikrolitre FACS tamponu içeren yeni bir FACS tüpüne aktarın.
Hücre süspansiyonunu santrifüjleme ile pelet haline getirin ve% 0.04 BSA ile 50 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 0.2 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan hücreleri toplamak için orijinal tüpe BSA'lı 50 mikrolitre PBS ekleyin. Toplam 100 mikrolitre hacme ulaşmak için hücreleri 0,2 mililitrelik tüpe aktarın.
Çekirdek izolasyonu için en iyi lizis zamanını belirlemek için bir pilot deney yapın. Çekirdekleri peletledikten sonra, çekirdek peletini 12 mikrolitre seyreltilmiş çekirdek tamponunda yeniden süspanse edin. %0,4 tripan mavisi ve %0,04 BSA içeren sekiz mikrolitre PBS içeren bir tüpe iki mikrolitre çekirdek ekleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak çekirdekleri sayın.
Çekirdek izolasyonunu tamamladıktan sonra, altı mikrolitre çekirdek yeniden süspansiyonunu 150 mikrolitre FACS tamponu ile önceden doldurulmuş yeni bir FACS tüpüne aktarın. Üç mikrolitre 7-AAD ekleyin ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin.
