Bereiten Sie zunächst ein DMEM-Zellkulturmedium vor, das FBS, Penicillin und Streptomycin enthält. Bereiten Sie außerdem eine 100-millimolare Kobaltchlorid-Stammlösung vor, indem Sie 1,30 Milligramm Kobaltchlorid zu 100 Mikrolitern DMSO hinzufügen. Als nächstes wird ein Milliliter BEND3-Zellen in eine 100-Milliliter-Kulturschale mit DMEM-Medium gesät und bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid kultiviert.
Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und subkultivieren Sie die Zellen zweimal pro Woche. Nachdem die BEND3-Zellen auf 80 % Konfluenz angewachsen sind, verdauen Sie die Zellen 30 Sekunden lang mit 0,25 % Trypsin. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und stellen Sie eine Suspension der Dichte sieben mal 10 bis zur vierten Zelle pro Milliliter her.
Säen Sie dann 100 Mikroliter dieser Zellsuspension in eine 96-Well-Platte für die Zelladhäsion. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen und 100 Mikroliter kobaltchloridhaltiges Nährmedium zugegeben. Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.
Nach der Inkubation das Medium entfernen und mit PBS waschen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter CCK-8-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und messen Sie dann die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader.
Berechnen Sie die durch Kobaltchlorid induzierte Zelllebensfähigkeit nach dieser Formel. Wählen Sie die Konzentration mit einem signifikanten Unterschied in der Reduktion der Zellviabilität im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Lebensfähigkeit von BEND3-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Kobaltchlorid behandelt wurden, wurde mit CoCl2 analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass 300 Mikromolar Kobaltchlorid eine signifikante In-vitro-Zytotoxizität aufwiesen.
