Plaats om te beginnen de met hematoxyline en eosine gekleurde neusslijmvliesweefselsecties van ratten op een microscooptafel. Pas de focus van de microscoop aan totdat het beeld duidelijk zichtbaar is. Leg het weefselbeeld vast met 40X.
Verwarm de citraatfosfaatbuffer tot het kookt. Voeg vervolgens de dia's toe aan de container nadat u deze van het vuur hebt gehaald. Na acht minuten verwarmen tot het kookt, zet u het vuur acht minuten uit en schakelt u vervolgens zeven minuten over naar middelhoog vuur.
Nadat u de container op natuurlijke wijze hebt laten afkoelen, brengt u de plakjes over naar PBS. Gebruik een ontkleurende shaker om de plakjes vijf minuten te schudden. Teken vervolgens een cirkel rond het gedroogde weefsel met een immunohistochemische pen.
Voeg 3% waterstofperoxide-oplossing toe aan de plakjes voordat u ze incubeert. Breng de plakjes vervolgens over naar PBS om te wassen zoals voorheen. Om te blokkeren, breng je 5% geitenserum aan binnen de gemarkeerde cirkel.
Verwijder na incubatie voorzichtig de blokkerende oplossing en voeg één tot twee milliliter FOXP3 toe aan de weefselplakjes. Plaats de plakjes vervolgens in een vochtige kamer voor een nacht incubatie. Dep de plakjes na het wassen in PBS voorzichtig droog met filtreerpapier.
Voeg vervolgens één tot twee milliliter van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de plakjes. Incubeer vervolgens de plakjes in 100 microliter tyramidesignaalversterkende werkoplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de plakjes na incubatie driemaal gedurende vijf minuten met PBS.
Breng nu één tot twee milliliter DAPI-kleuringsoplossing aan op de plakjes vóór de incubatie. Blus de automatische fluorescentie door de plakjes vijf minuten in de quencher te incuberen voordat ze 10 minuten PBS-wasbeurt ondergaan. Sluit ze vervolgens af met de antifluorescentieblusser.
Leg de microscopische beelden van de gekleurde delen vast onder een vergroting van 20x en 40x. Hematoxyline- en eosinekleuring van de controleratten vertoonden goed gerangschikte epitheelcellen en trilhaartjes. Het neustussenschotslijmvlies was beschadigd en losgelaten in de ziektegroep met opmerkelijke neutrofieleninfiltratie.
Multi-immunofluorescerende kleuring toonde aan dat de expressies van ROR Gamma T en TCAM1 verhoogd waren in de ziektegroep. FOXP3 was echter onderbedrukt.