Name: Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans
Uploaded: 2024-01-26T13:00:00
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lifespan machine experiment preparation and setup for lifespan and behavioral aging assays on caenorhabditis elegans

Enthüllung der Geheimnisse des Alterns: Lifespan Machine für Erkenntnisse mit hohem Durchsatz

Aging is a complex, multifaceted process characterized by a decline in the physiological function of an organism, which leads to an increase in the risk of disease and death over time1. Lifespan, measured as the time from birth or the onset of adulthood until death, provides an unambiguous outcome of aging2 and an indirect but rigorously quantitative proxy for measuring the relative rate of aging between populations3. Aging studies often depend on accurate measurements of lifespan, similar to clinical trials, to compare outcomes between one population exposed to an intervention and an unexposed control group. Unfortunately, reproducibility issues pervade aging research, sometimes due to statistically underpowered experiments4 and often because of the inherent sensitivity of lifespan assays to subtle variations in the environment5. Robust experiments require multiple replicates of large populations, and this process particularly benefits from the experimental scalability offered by automation6.
The rigorous demands of lifespan assays originate from the unpredictability of the aging process itself. Isogenic individuals housed in identical environments display different death times and rates of physiological decline7, suggesting that lifespan involves a high degree of stochasticity7,8. Therefore, large populations are required to measure quantitative changes in the aging process, such as changes in the mean or maximum lifespan, and to overcome biases arising from individual variability. In addition, a capacity for high-throughput lifespan assays is crucial to support studies of survival curve shapes and models of the dynamics of aging9.
The nematode Caenorhabditis elegans is an invaluable model for aging research due to its short lifespan, genetic tractability, and rapid generation time, which underscore its suitability for high-throughput aging and lifespan assays. Traditionally, the lifespan in C. elegans has been measured by following a synchronized, small population of about 50-100 animals over time on solid media and writing down the time of individual deaths. As animals age and lose mobility, manually scoring the death times requires individually prodding the animals and checking for small movements of the head or tail. This is usually a tedious and laborious process, though efforts have been made to accelerate it10,11,12. Importantly, slow experimental pipelines hinder progress in our understanding of aging and the effectiveness of tested interventions.
To meet the demands of aging research for quantitative data, many technologies have been developed for automating data collection, including a remarkable range of approaches from microfluidic chambers to flatbed scanners13,14,15,16,17,18. The LSM differs from other methods in its extensive optimization for the collection of highly precise and accurate lifespan data, which is achieved through the development of careful equipment calibration protocols combined with an extensive software suite that allows users to validate, correct, and refine automated analyses13. Though the software can, in principle, be applied to diverse imaging modalities, in practice, most users use flatbed scanners modified to allow for fine-tuned control over the environmental temperature and humidity - factors of critical importance due to their major effect on lifespan19. The LSM takes images of nematodes every 20 min over intervals ranging from days to months, depending on the environmental conditions and genotype. The data produced are of much higher temporal resolution compared to data from manual assays, and the images collected provide a permanent visual record of the nematode position across the lifespan. Using machine-learning methods, death times are automatically assigned to each individual. These results can be rapidly, manually validated using a client software called &#34;Worm Browser&#34;. As a result of its hardware and software, the LSM can generate survival curves that are statistically indistinguishable from manual death scoring at the hands of experienced researchers, with the added advantage of decreased workload and higher scalability13.
The latest version of the LSM also allows for the study of behavioral aging by collecting morphological and behavioral data throughout the nematode&#39;s life and reporting it along with the lifespan of each individual. In particular, the LSM captures the time of each animal&#39;s vigorous movement cessation (VMC), a landmark often used to quantify the &#34;healthspan&#34; of an individual as distinct from its lifespan. By simultaneously collecting lifespan and behavioral aging data, the LSM supports the study of interventions that may have differential effects on different phenotypic outcomes of aging20. A variety of macroscopically observable phenotypes can be used to study behavioral aging, such as body movement or pharyngeal pumping21, tissue integrity22, and movement speed or stimulus-induced turning17. Comparisons between different aging phenotypes can support analyses of the causal structure of aging processes. For instance, the comparison between VMC and lifespan was recently used to characterize two distinct aging processes in C. elegans23.
While initially developed to measure lifespan in C. elegans, the LSM supports the collection of survival and behavioral data from a range of nematode species, including C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, and P. pacificus23. The technology facilitates the study of the effect of biological and environmental interventions on lifespan, stress resistance, and pathogen resistance and can be coupled to experimental tools such as targeted assays of RNA interference or auxin-inducible protein degradation systems. To date, it has been used in the scientific literature for a wide range of applications6,24,25,26,27,28,29,30.
Here, we outline a step-by-step protocol for performing a Lifespan Machine experiment using agar plates, from the initial stages of the experimental setup to the output of the resulting survival curves. A distinctive feature of the LSM is that the effort is highly front-loaded, meaning that the majority of the researcher&#39;s time is spent during experimental setup and, to a small degree, during post-image&#160;acquisition. The data collection is completely automated for the whole duration of the experiment and allows the researcher to have a &#34;hands-free&#34; experience. The steps described here are held in common among many different types of survival assays - the same experimental setup is performed for lifespan, thermotolerance, oxidative stress, and pathogenesis assays. In the representative results section, we discuss a subset of data from a recently published manuscript to illustrate the effectiveness of the analysis pipeline and highlight the most important steps during image analysis23.

Autor im Rampenlicht: Automatisiertes Lifespan Monitoring – Entdeckung der Alterungsdynamik mit der Lifespan Machine 

Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

In our lab, we study the physiological and molecular determinants of aging and lifespan, and we do so in a quantitative manner. For this, we use the nematode C.elegans as a fast-aging genetically tractable model, and we use it with a combination of tools such as the Lifespan Machine. Reproducibility is an important issue in aging research.To overcome this, large population of animals are often required for measuring robust changes in lifespan, and therefore, this process really benefits from automated high-throughput protocols. Lots of people have used the Lifespan Machine for many different purposes and are really happy about that. For our own applications, the two most significant findings are, first, in 2016, our discovery of temporal scaling as a common outcome of many interventions in aging.And second, in 2022, our discovery that healthspan and lifespan are determined by distinct underlying physical declines. The Lifespan Machine adapts commonly used agar plate protocols to collect survival and behavioral aging data from large populations of nematodes. By automation and high-frequency of image acquisition, it eliminates the daily tedious process of by-hand survival assays and gathers previously unattainable datasets on nematode behavior.

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Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans   

Vorbereitung und Aufbau von Lifespan Machine Experiment für Lifespan and Behavioral Aging Assays an Caenorhabditis elegans

Stellen Sie zunächst sicher, dass die Scannerplatten mit geladenen Nematoden bereit sind. Im Allgemeinen sind etwa 40 Tiere und 200 Mikroliter Bakterienrasen pro Platte optimale Bedingungen für ein lebenslanges Experiment. Beginnen Sie den Versuchsaufbau, indem Sie auf beiden Seiten der Glasscheiben einen Anti-Beschlag-Glasreiniger auftragen, der die Scannerplatten stützt.Tragen Sie dann eine hydrophobe Schutzglasbehandlung auf die Seite des Glases auf, die mit den Scannerplatten in Kontakt kommt. Warten Sie fünf bis 10 Minuten und entfernen Sie alle Rückstände auf der Glasscheibe. Tragen Sie 70%iges Ethanol auf, um die Seite des Glases zu desinfizieren, die mit den Scannerplatten in Berührung kommt.Ein bis zwei Minuten einwirken lassen und dann das Ethanol mit einem Tuch oder Papiertuch entfernen. Um die Platten auf die Scanner zu laden, legen Sie die Autoklaven-Gummimatten auf das behandelte Plattenträgerglas. Nehmen Sie die Scannerplatten, die für die Bildgebung mit geladenen Nematoden verwendet werden, und entfernen Sie den Deckel.Legen Sie die Platten auf Gummimatten, die der Glasoberfläche zugewandt sind. Ziehen Sie den Netzstecker der Scannerlüfter, um die Finger des Versuchsleiters während des Einlegens der Platte zu schützen. Schieben Sie die Platten und die sie stützenden Glasscheiben vorsichtig auf die Oberfläche des Scanners.Aktivieren Sie die Scannerlüfter wieder und vergewissern Sie sich, dass die vorderen und seitlichen Lüfter mit Strom versorgt werden. Schalten Sie an dieser Stelle die Scanner ein. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, führen Sie die wesentlichen Schritte vor der Bildaufnahme durch, einschließlich der Erstellung eines Vorschaubildes der gesamten Scanneroberfläche.Suchen Sie über die Weboberfläche den Abschnitt "Bilderfassung" auf der Hauptseite und folgen Sie dem Link "Aufnahmegeräte und Bildserver". Klicken Sie im geöffneten Feld auf Nach neuen Geräten suchen und stellen Sie sicher, dass jeder an den Server angeschlossene Scanner im Feld Bilderfassungsgeräte angezeigt wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für jeden Scanner, der neu geladene Platten enthält, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Vorschauaufnahme anfordern.Wählen Sie als Nächstes im Worm-Browser die Option Datei "Bild öffnen" und wählen Sie dann das gewünschte Bild aus, um die einzelnen Vorschaubilder zu öffnen. Klicken Sie für jedes Bild auf die Spalten, die den Bereichen entsprechen, die Platten enthalten. Sobald alle Bilder definiert sind, wählen Sie Bilderfassung aus.Definieren Sie Scanbereiche, speichern Sie ausgewählte Scanbereiche auf einem Datenträger, und wählen Sie dann den gewünschten Speicherort aus, um die Spezifikationen des Bereichs auf den Datenträger zu exportieren. Stellen Sie eine Datei zusammen, die den Namen des Experiments, die physischen Positionen der einzelnen Spalten auf den Scannern, die Gesamtdauer des Experiments und die Häufigkeit der Bildaufnahme enthält. Speichern Sie diese als Text- und XML-Datei.Klicken Sie im Worm-Browser auf Bilderfassung, senden Sie den Versuchsplan und wählen Sie die generierte XML-Datei aus. Der Worm-Browser fragt Sie, ob eine Zusammenfassung des Zeitplans ausgegeben oder das Experiment ausgeführt werden soll. Generieren Sie eine Zusammenfassungsdatei, überprüfen Sie die Daten der geplanten Erfassungen, den Speicherort, den Namen und die Anzahl der Scanner in der Zusammenfassung.Laden Sie erneut die XML-Datei für den Experimentzeitplan, wie gezeigt. Der Worm-Browser fragt ein zweites Mal, ob eine Zusammenfassung des Zeitplans ausgegeben oder das Experiment ausgeführt werden soll. Wählen Sie dieses Mal aus, dass Sie das Experiment ausführen möchten.Die Lifespan-Maschine arbeitet nun autonom, bis die letzten Scans, die im Versuchsplan angegeben sind, abgeschlossen sind. Nachdem das Experiment beendet ist und alle Schritte zur Bild- und Portoerfassung durchgeführt wurden, überprüfen Sie die automatisierten Ergebnisse manuell mithilfe des Worm-Browsers. Klicken Sie im Menü des Worm-Browsers auf Datei, wählen Sie das aktuelle Experiment aus und wählen Sie das gewünschte Experiment aus.Um das Storyboard zu generieren, klicken Sie auf Validierung, durchsuchen Sie das gesamte Experiment und wählen Sie dann unmittelbar nach dem Tod jedes Wurms aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild des Objekts, um Nicht-Wurm-Objekte aus dem Storyboard auszuschließen. Um alle Objekte auf einer Seite gleichzeitig auszuschließen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein beliebiges Objekt.Klicken Sie zweimal mit der rechten Maustaste, um ein ausgeschlossenes Objekt erneut in die Analyse einzubeziehen. Um die während der Storyboard-Anmerkung erstellten Anmerkungen zu speichern, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern. Klicken Sie einmal mit der linken Maustaste auf ein beliebiges Objekt des Storyboards, um ein neues Fenster zu öffnen, in dem detaillierte Zeitreiheninformationen zu diesem Objekt angezeigt werden.Um die Todeszeiten manuell zu kommentieren, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die untere Leiste an der Stelle, die dem Zeitpunkt des Todes entspricht. Verwenden Sie die Leertaste und die Pfeile nach rechts oder links auf der Tastatur, um sich durch die Zeitrahmen zu bewegen, oder klicken Sie direkt auf die Leiste im gewünschten Zeitrahmen. Kommentieren Sie die Kontraktions- und Expansionsereignisse manuell, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die untere Leiste im gewünschten Zeitrahmen klicken.Sehen Sie sich die Überlebenskurven auf der linken Seite und das Streudiagramm an, in dem der Zeitpunkt der Beendigung der Bewegung mit dem Todeszeitpunkt für jedes Individuum auf der rechten Seite des Storyboards verglichen wird. Um die Todeszeiten für ein Experiment zu generieren, wählen Sie im Worm-Browser Datendateien und Sterbezeiten aus und klicken Sie dann auf Sterbezeiten für aktuelles Experiment generieren. Der Effekt der manuellen Datenvalidierung auf die Überlebenskurven wird hier gezeigt.Die anfänglichen Überlebenskurven, die vor der Storyboard-Anmerkung erstellt wurden, wurden durch die unsachgemäße Einbeziehung der Nicht-Wurm-Objekte verzerrt. Nach dem Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten während der manuellen Storyboard-Anmerkung zeigten die resultierenden Überlebenskurven eine deutlich verbesserte Auflösung. Die grafische Darstellung zeigt die geschätzte durchschnittliche verbleibende Lebensdauer in verschiedenen Schritten der Analyse nach der Bildaufnahme und ihre Korrelation mit der Lebensdauer des Wurms.Es wurde festgestellt, dass die manuelle Annotation der Sterbezeiten in der Verhaltensalterungsanalyse besonders wichtig bei länger lebenden Würmern ist. In diesem Fall diejenigen, die den geringsten Konzentrationen von Ochsen ausgesetzt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die automatisierte Schätzung der Todeszeit der Lebensspannenmaschine für Überlebenstests ausreichend genau ist.Während Behavioral Aging Assays von manuellen Annotationen profitieren können.

Research

JoVE Journal

Biology

Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans

High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine

Genetically identical animals kept in a constant environment display a wide distribution of lifespans, reflecting a large non-genetic, stochastic aspect ...