Name: Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans
Uploaded: 2024-01-26T13:00:00
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lifespan machine experiment preparation and setup for lifespan and behavioral aging assays on caenorhabditis elegans

Svelare i misteri dell'invecchiamento: Lifespan Machine per approfondimenti ad alto rendimento

Aging is a complex, multifaceted process characterized by a decline in the physiological function of an organism, which leads to an increase in the risk of disease and death over time1. Lifespan, measured as the time from birth or the onset of adulthood until death, provides an unambiguous outcome of aging2 and an indirect but rigorously quantitative proxy for measuring the relative rate of aging between populations3. Aging studies often depend on accurate measurements of lifespan, similar to clinical trials, to compare outcomes between one population exposed to an intervention and an unexposed control group. Unfortunately, reproducibility issues pervade aging research, sometimes due to statistically underpowered experiments4 and often because of the inherent sensitivity of lifespan assays to subtle variations in the environment5. Robust experiments require multiple replicates of large populations, and this process particularly benefits from the experimental scalability offered by automation6.
The rigorous demands of lifespan assays originate from the unpredictability of the aging process itself. Isogenic individuals housed in identical environments display different death times and rates of physiological decline7, suggesting that lifespan involves a high degree of stochasticity7,8. Therefore, large populations are required to measure quantitative changes in the aging process, such as changes in the mean or maximum lifespan, and to overcome biases arising from individual variability. In addition, a capacity for high-throughput lifespan assays is crucial to support studies of survival curve shapes and models of the dynamics of aging9.
The nematode Caenorhabditis elegans is an invaluable model for aging research due to its short lifespan, genetic tractability, and rapid generation time, which underscore its suitability for high-throughput aging and lifespan assays. Traditionally, the lifespan in C. elegans has been measured by following a synchronized, small population of about 50-100 animals over time on solid media and writing down the time of individual deaths. As animals age and lose mobility, manually scoring the death times requires individually prodding the animals and checking for small movements of the head or tail. This is usually a tedious and laborious process, though efforts have been made to accelerate it10,11,12. Importantly, slow experimental pipelines hinder progress in our understanding of aging and the effectiveness of tested interventions.
To meet the demands of aging research for quantitative data, many technologies have been developed for automating data collection, including a remarkable range of approaches from microfluidic chambers to flatbed scanners13,14,15,16,17,18. The LSM differs from other methods in its extensive optimization for the collection of highly precise and accurate lifespan data, which is achieved through the development of careful equipment calibration protocols combined with an extensive software suite that allows users to validate, correct, and refine automated analyses13. Though the software can, in principle, be applied to diverse imaging modalities, in practice, most users use flatbed scanners modified to allow for fine-tuned control over the environmental temperature and humidity - factors of critical importance due to their major effect on lifespan19. The LSM takes images of nematodes every 20 min over intervals ranging from days to months, depending on the environmental conditions and genotype. The data produced are of much higher temporal resolution compared to data from manual assays, and the images collected provide a permanent visual record of the nematode position across the lifespan. Using machine-learning methods, death times are automatically assigned to each individual. These results can be rapidly, manually validated using a client software called &#34;Worm Browser&#34;. As a result of its hardware and software, the LSM can generate survival curves that are statistically indistinguishable from manual death scoring at the hands of experienced researchers, with the added advantage of decreased workload and higher scalability13.
The latest version of the LSM also allows for the study of behavioral aging by collecting morphological and behavioral data throughout the nematode&#39;s life and reporting it along with the lifespan of each individual. In particular, the LSM captures the time of each animal&#39;s vigorous movement cessation (VMC), a landmark often used to quantify the &#34;healthspan&#34; of an individual as distinct from its lifespan. By simultaneously collecting lifespan and behavioral aging data, the LSM supports the study of interventions that may have differential effects on different phenotypic outcomes of aging20. A variety of macroscopically observable phenotypes can be used to study behavioral aging, such as body movement or pharyngeal pumping21, tissue integrity22, and movement speed or stimulus-induced turning17. Comparisons between different aging phenotypes can support analyses of the causal structure of aging processes. For instance, the comparison between VMC and lifespan was recently used to characterize two distinct aging processes in C. elegans23.
While initially developed to measure lifespan in C. elegans, the LSM supports the collection of survival and behavioral data from a range of nematode species, including C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, and P. pacificus23. The technology facilitates the study of the effect of biological and environmental interventions on lifespan, stress resistance, and pathogen resistance and can be coupled to experimental tools such as targeted assays of RNA interference or auxin-inducible protein degradation systems. To date, it has been used in the scientific literature for a wide range of applications6,24,25,26,27,28,29,30.
Here, we outline a step-by-step protocol for performing a Lifespan Machine experiment using agar plates, from the initial stages of the experimental setup to the output of the resulting survival curves. A distinctive feature of the LSM is that the effort is highly front-loaded, meaning that the majority of the researcher&#39;s time is spent during experimental setup and, to a small degree, during post-image&#160;acquisition. The data collection is completely automated for the whole duration of the experiment and allows the researcher to have a &#34;hands-free&#34; experience. The steps described here are held in common among many different types of survival assays - the same experimental setup is performed for lifespan, thermotolerance, oxidative stress, and pathogenesis assays. In the representative results section, we discuss a subset of data from a recently published manuscript to illustrate the effectiveness of the analysis pipeline and highlight the most important steps during image analysis23.

Autore in primo piano: Monitoraggio automatizzato della durata della vita - Alla scoperta delle dinamiche dell'invecchiamento con la Lifespan Machine 

Saggi sull'invecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita

In our lab, we study the physiological and molecular determinants of aging and lifespan, and we do so in a quantitative manner. For this, we use the nematode C.elegans as a fast-aging genetically tractable model, and we use it with a combination of tools such as the Lifespan Machine. Reproducibility is an important issue in aging research.To overcome this, large population of animals are often required for measuring robust changes in lifespan, and therefore, this process really benefits from automated high-throughput protocols. Lots of people have used the Lifespan Machine for many different purposes and are really happy about that. For our own applications, the two most significant findings are, first, in 2016, our discovery of temporal scaling as a common outcome of many interventions in aging.And second, in 2022, our discovery that healthspan and lifespan are determined by distinct underlying physical declines. The Lifespan Machine adapts commonly used agar plate protocols to collect survival and behavioral aging data from large populations of nematodes. By automation and high-frequency of image acquisition, it eliminates the daily tedious process of by-hand survival assays and gathers previously unattainable datasets on nematode behavior.

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Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans   

Preparazione e configurazione dell'esperimento della macchina per la durata della vita e saggi di invecchiamento comportamentale su Caenorhabditis elegans

Per iniziare, assicurarsi che le piastre dello scanner siano pronte con i nematodi caricati. In generale, circa 40 animali e 200 microlitri di prato batterico per piatto sono le condizioni ottimali per un esperimento che dura tutta la vita. Iniziare la configurazione sperimentale applicando un detergente antiappannamento per vetri su entrambi i lati delle lastre di vetro che sosterranno le piastre dello scanner.Quindi applicare un trattamento protettivo idrofobico per vetri sul lato del vetro che sarà a contatto con le piastre dello scanner. Attendere da cinque a 10 minuti e rimuovere eventuali residui sulla lastra di vetro. Applicare etanolo al 70% per disinfettare il lato del vetro che sarà a contatto con le piastre dello scanner.Lasciare agire per uno o due minuti e poi rimuovere l'etanolo con un panno o un tovagliolo di carta. Per caricare le piastre sugli scanner, posizionare i tappetini in gomma dell'autoclave sopra il vetro di supporto della piastra trattato. Prendere le piastre dello scanner utilizzate per l'imaging con i nematodi caricati e rimuovere il coperchio.Posizionare le piastre su un tappetino di gomma rivolto verso la superficie del vetro. Scollegare le ventole dello scanner per proteggere le dita dello sperimentatore durante il caricamento della piastra. Far scorrere delicatamente le lastre e le lastre di vetro che le sostengono sulla superficie dello scanner.Riattivare le ventole dello scanner e verificare che le ventole anteriori e laterali siano alimentate. A questo punto accendi gli scanner. Prima di iniziare l'esperimento, eseguire i passaggi essenziali di acquisizione pre-immagine, incluso l'ottenimento di un'immagine di acquisizione in anteprima dell'intera superficie dello scanner.Utilizzando l'interfaccia web, trova la sezione di acquisizione delle immagini della pagina principale e segui il link chiamato Dispositivi di acquisizione e server di immagini. Nella casella aperta, fare clic su Cerca nuovi dispositivi e assicurarsi che ogni scanner collegato al server venga visualizzato nella casella Dispositivi di acquisizione delle immagini. Selezionare la casella di controllo corrispondente a ciascuno scanner contenente le lastre appena caricate, quindi fare clic sul pulsante Richiedi acquisizione anteprima.Successivamente, nel browser Worm, selezionare l'immagine di apertura del file, quindi scegliere l'immagine desiderata per aprire ogni immagine di acquisizione in anteprima. Per ogni immagine, fare clic per selezionare le colonne corrispondenti alle regioni contenenti lastre. Una volta definite tutte le immagini, selezionare l'acquisizione delle immagini.Definire le aree di scansione, salvare le aree di scansione selezionate su disco, quindi scegliere la posizione desiderata per esportare le specifiche della regione su disco. Assemblare un file contenente il nome dell'esperimento, le posizioni fisiche di ogni colonna sugli scanner, la durata totale dell'esperimento e la frequenza di acquisizione dell'immagine. Salvalo come file di testo e XML.Nel browser Worm, fare clic su acquisizione immagini, inviare la pianificazione dell'esperimento e scegliere il file XML generato. Il browser Worm chiederà se visualizzare un riepilogo della pianificazione o eseguire l'esperimento. Generare un file di riepilogo, verificare le date delle acquisizioni pianificate, la posizione, il nome e il numero di scanner nel riepilogo.Anche in questo caso, caricare il file XML per la pianificazione dell'esperimento come illustrato. Il browser Worm chiederà una seconda volta se visualizzare un riepilogo della pianificazione o se eseguire l'esperimento. Questa volta, scegli di eseguire l'esperimento.La macchina per la durata di vita funzionerà ora in modo autonomo fino al completamento delle scansioni finali specificate nel programma dell'esperimento. Al termine dell'esperimento e dopo aver eseguito tutte le fasi di acquisizione delle immagini e dell'affrancatura, convalidare manualmente i risultati automatici utilizzando il browser Worm. Nel menu del browser Worm, fare clic su file, selezionare l'esperimento corrente e scegliere l'esperimento desiderato.Per generare lo storyboard, fare clic su convalida, sfogliare l'intero esperimento, quindi selezionare immediatamente dopo la morte di ogni worm. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine dell'oggetto per escludere oggetti non worm dallo storyboard. Per escludere contemporaneamente tutti gli oggetti di una pagina, tieni premuto il tasto Ctrl e fai clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi oggetto.Fare clic due volte con il pulsante destro del mouse per includere nuovamente un oggetto escluso nell'analisi. Per salvare le annotazioni effettuate durante l'annotazione dello storyboard, fare clic sul pulsante Salva. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse una volta su qualsiasi oggetto dello storyboard per aprire una nuova finestra in cui vengono visualizzate informazioni dettagliate sulle serie temporali relative a tale oggetto.Per annotare manualmente gli orari di morte, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla barra in basso nel punto corrispondente all'ora di morte. Usa la barra spaziatrice e le frecce destra o sinistra della tastiera per spostarti tra gli intervalli di tempo o fai clic direttamente sulla barra nell'intervallo di tempo desiderato. Annota manualmente gli eventi di contrazione ed espansione facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla barra in basso nell'intervallo di tempo desiderato.Guarda le curve di sopravvivenza sul lato sinistro e il grafico a dispersione che confronta il momento di cessazione del movimento vigoroso con il momento della morte per ogni individuo sul lato destro dello storyboard. Per generare i tempi di morte per un esperimento, nel browser Worm selezionare i file di dati, i tempi di morte, quindi fare clic su Genera tempi di morte per l'esperimento corrente. Di seguito è riportato l'effetto della convalida manuale dei dati sulle curve di sopravvivenza.Le curve di sopravvivenza iniziali prodotte prima dell'annotazione dello storyboard sono state distorte dall'inclusione impropria degli oggetti non worm. Dopo aver escluso gli oggetti non vermi durante l'annotazione manuale dello storyboard, le curve di sopravvivenza risultanti hanno mostrato una risoluzione significativamente migliorata. La rappresentazione grafica mostra la durata media residua stimata nelle diverse fasi dell'analisi post-acquisizione dell'immagine e la sua correlazione con la durata della vita del verme.È stato scoperto che l'annotazione manuale dei tempi di morte nell'analisi dell'invecchiamento comportamentale è particolarmente importante nei vermi a vita più lunga. In questo caso, quelli esposti alle concentrazioni più basse di buoi. In conclusione, la stima automatizzata del tempo di morte della macchina della vita è sufficientemente accurata per i saggi di sopravvivenza.Mentre i saggi di invecchiamento comportamentale possono trarre vantaggio dall'annotazione manuale.

Research

JoVE Journal

Biology

Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans

High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine

Genetically identical animals kept in a constant environment display a wide distribution of lifespans, reflecting a large non-genetic, stochastic aspect ...