Name: Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans
Uploaded: 2024-01-26T13:00:00
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lifespan machine experiment preparation and setup for lifespan and behavioral aging assays on caenorhabditis elegans

Desvelando los misterios del envejecimiento: Lifespan Machine para obtener información de alto rendimiento

Aging is a complex, multifaceted process characterized by a decline in the physiological function of an organism, which leads to an increase in the risk of disease and death over time1. Lifespan, measured as the time from birth or the onset of adulthood until death, provides an unambiguous outcome of aging2 and an indirect but rigorously quantitative proxy for measuring the relative rate of aging between populations3. Aging studies often depend on accurate measurements of lifespan, similar to clinical trials, to compare outcomes between one population exposed to an intervention and an unexposed control group. Unfortunately, reproducibility issues pervade aging research, sometimes due to statistically underpowered experiments4 and often because of the inherent sensitivity of lifespan assays to subtle variations in the environment5. Robust experiments require multiple replicates of large populations, and this process particularly benefits from the experimental scalability offered by automation6.
The rigorous demands of lifespan assays originate from the unpredictability of the aging process itself. Isogenic individuals housed in identical environments display different death times and rates of physiological decline7, suggesting that lifespan involves a high degree of stochasticity7,8. Therefore, large populations are required to measure quantitative changes in the aging process, such as changes in the mean or maximum lifespan, and to overcome biases arising from individual variability. In addition, a capacity for high-throughput lifespan assays is crucial to support studies of survival curve shapes and models of the dynamics of aging9.
The nematode Caenorhabditis elegans is an invaluable model for aging research due to its short lifespan, genetic tractability, and rapid generation time, which underscore its suitability for high-throughput aging and lifespan assays. Traditionally, the lifespan in C. elegans has been measured by following a synchronized, small population of about 50-100 animals over time on solid media and writing down the time of individual deaths. As animals age and lose mobility, manually scoring the death times requires individually prodding the animals and checking for small movements of the head or tail. This is usually a tedious and laborious process, though efforts have been made to accelerate it10,11,12. Importantly, slow experimental pipelines hinder progress in our understanding of aging and the effectiveness of tested interventions.
To meet the demands of aging research for quantitative data, many technologies have been developed for automating data collection, including a remarkable range of approaches from microfluidic chambers to flatbed scanners13,14,15,16,17,18. The LSM differs from other methods in its extensive optimization for the collection of highly precise and accurate lifespan data, which is achieved through the development of careful equipment calibration protocols combined with an extensive software suite that allows users to validate, correct, and refine automated analyses13. Though the software can, in principle, be applied to diverse imaging modalities, in practice, most users use flatbed scanners modified to allow for fine-tuned control over the environmental temperature and humidity - factors of critical importance due to their major effect on lifespan19. The LSM takes images of nematodes every 20 min over intervals ranging from days to months, depending on the environmental conditions and genotype. The data produced are of much higher temporal resolution compared to data from manual assays, and the images collected provide a permanent visual record of the nematode position across the lifespan. Using machine-learning methods, death times are automatically assigned to each individual. These results can be rapidly, manually validated using a client software called &#34;Worm Browser&#34;. As a result of its hardware and software, the LSM can generate survival curves that are statistically indistinguishable from manual death scoring at the hands of experienced researchers, with the added advantage of decreased workload and higher scalability13.
The latest version of the LSM also allows for the study of behavioral aging by collecting morphological and behavioral data throughout the nematode&#39;s life and reporting it along with the lifespan of each individual. In particular, the LSM captures the time of each animal&#39;s vigorous movement cessation (VMC), a landmark often used to quantify the &#34;healthspan&#34; of an individual as distinct from its lifespan. By simultaneously collecting lifespan and behavioral aging data, the LSM supports the study of interventions that may have differential effects on different phenotypic outcomes of aging20. A variety of macroscopically observable phenotypes can be used to study behavioral aging, such as body movement or pharyngeal pumping21, tissue integrity22, and movement speed or stimulus-induced turning17. Comparisons between different aging phenotypes can support analyses of the causal structure of aging processes. For instance, the comparison between VMC and lifespan was recently used to characterize two distinct aging processes in C. elegans23.
While initially developed to measure lifespan in C. elegans, the LSM supports the collection of survival and behavioral data from a range of nematode species, including C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, and P. pacificus23. The technology facilitates the study of the effect of biological and environmental interventions on lifespan, stress resistance, and pathogen resistance and can be coupled to experimental tools such as targeted assays of RNA interference or auxin-inducible protein degradation systems. To date, it has been used in the scientific literature for a wide range of applications6,24,25,26,27,28,29,30.
Here, we outline a step-by-step protocol for performing a Lifespan Machine experiment using agar plates, from the initial stages of the experimental setup to the output of the resulting survival curves. A distinctive feature of the LSM is that the effort is highly front-loaded, meaning that the majority of the researcher&#39;s time is spent during experimental setup and, to a small degree, during post-image&#160;acquisition. The data collection is completely automated for the whole duration of the experiment and allows the researcher to have a &#34;hands-free&#34; experience. The steps described here are held in common among many different types of survival assays - the same experimental setup is performed for lifespan, thermotolerance, oxidative stress, and pathogenesis assays. In the representative results section, we discuss a subset of data from a recently published manuscript to illustrate the effectiveness of the analysis pipeline and highlight the most important steps during image analysis23.

Autor destacado: Monitoreo automatizado de la vida útil: descubriendo la dinámica del envejecimiento con la máquina de vida útil 

Ensayos de envejecimiento conductual y vida útil de alto rendimiento con la máquina Lifespan

In our lab, we study the physiological and molecular determinants of aging and lifespan, and we do so in a quantitative manner. For this, we use the nematode C.elegans as a fast-aging genetically tractable model, and we use it with a combination of tools such as the Lifespan Machine. Reproducibility is an important issue in aging research.To overcome this, large population of animals are often required for measuring robust changes in lifespan, and therefore, this process really benefits from automated high-throughput protocols. Lots of people have used the Lifespan Machine for many different purposes and are really happy about that. For our own applications, the two most significant findings are, first, in 2016, our discovery of temporal scaling as a common outcome of many interventions in aging.And second, in 2022, our discovery that healthspan and lifespan are determined by distinct underlying physical declines. The Lifespan Machine adapts commonly used agar plate protocols to collect survival and behavioral aging data from large populations of nematodes. By automation and high-frequency of image acquisition, it eliminates the daily tedious process of by-hand survival assays and gathers previously unattainable datasets on nematode behavior.

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Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans   

Preparación y configuración del experimento de la máquina de vida útil para ensayos de envejecimiento de la vida útil y del comportamiento en Caenorhabditis elegans

Para comenzar, asegúrese de que las placas del escáner estén listas con los nematodos cargados. En general, alrededor de 40 animales y 200 microlitros de césped bacteriano por plato son las condiciones óptimas para un experimento de larga duración. Comience la configuración experimental aplicando un limpiador de vidrios antivaho en ambos lados de los paneles de vidrio que soportarán las placas del escáner.A continuación, aplique un tratamiento protector hidrofóbico con vidrio en el lado del vidrio que estará en contacto con las placas del escáner. Espere de cinco a 10 minutos y elimine cualquier residuo en el panel de vidrio. Aplique etanol al 70% para desinfectar el lado del vidrio que estará en contacto con las placas del escáner.Deje actuar durante uno o dos minutos y luego retire el etanol con un paño o una toalla de papel. Para cargar las placas en los escáneres, coloque las alfombrillas de goma del autoclave sobre el vidrio de soporte de la placa tratada. Tome las placas del escáner utilizadas para la obtención de imágenes con nematodos cargados y retire la tapa.Coloque las placas en lugares de goma frente a la superficie de vidrio. Desenchufe los ventiladores del escáner para proteger los dedos del experimentador durante la carga de la placa. Deslice suavemente las placas y las láminas de vidrio que las sostienen sobre la superficie del escáner.Vuelva a activar los ventiladores del escáner y confirme que los ventiladores frontal y lateral estén encendidos. Encienda los escáneres en este punto. Antes de comenzar el experimento, realice los pasos esenciales previos a la adquisición de imágenes, incluida la obtención de una imagen de captura de vista previa de toda la superficie del escáner.Usando la interfaz web, busque la sección de adquisición de imágenes de la página principal y siga el enlace llamado Dispositivos de captura y servidores de imágenes. En el cuadro abierto, haga clic en buscar nuevos dispositivos y asegúrese de que cada escáner conectado al servidor aparezca en el cuadro de dispositivos de captura de imágenes. Seleccione la casilla de verificación correspondiente a cada escáner que contenga placas recién cargadas y, a continuación, haga clic en el botón Solicitar captura de vista previa.A continuación, en el explorador de gusanos, seleccione imagen de archivo abierto y, a continuación, elija la imagen deseada para abrir cada imagen de captura de vista previa. Para cada imagen, haga clic para seleccionar las columnas correspondientes a las regiones que contienen placas. Una vez definidas todas las imágenes, seleccione adquisición de imágenes.Defina las áreas de escaneo, guarde las áreas de escaneo seleccionadas en el disco y, a continuación, elija la ubicación deseada para exportar las especificaciones de la región al disco. Reúna un archivo que contenga el nombre del experimento, las ubicaciones físicas de cada columna en los escáneres, la duración total del experimento y la frecuencia de captura de imágenes. Guárdelo como un archivo de texto y XML.En el navegador de gusanos, haga clic en adquisición de imágenes, envíe el programa de experimentos y elija el archivo XML generado. El navegador Worm le preguntará si desea generar un resumen de la programación o ejecutar el experimento. Genere un archivo de resumen, verifique las fechas de las capturas programadas, la ubicación, el nombre y el número de escáneres en el resumen.De nuevo, cargue el archivo XML para la programación del experimento como se muestra. El explorador de gusanos preguntará por segunda vez si desea generar un resumen de la programación o ejecutar el experimento. Esta vez, elija ejecutar el experimento.La vida útil de la máquina ahora funcionará de forma autónoma hasta que se completen los escaneos finales especificados en el programa del experimento. Una vez finalizado el experimento y realizados todos los pasos de adquisición de imágenes y franqueo, valide manualmente los resultados automatizados mediante el explorador de gusanos. En el menú del navegador Worm, haga clic en archivo, seleccione el experimento actual y elija el experimento deseado.Para generar el guión gráfico, haga clic en validación, examine todo el experimento y, a continuación, seleccione inmediatamente después de la muerte de cada gusano. Haga clic con el botón derecho en la imagen del objeto para excluir los objetos que no sean gusanos del guión gráfico. Para excluir todos los objetos de una página simultáneamente, mantenga presionada la tecla Control y haga clic con el botón derecho en cualquier objeto.Haga clic con el botón derecho del ratón dos veces para volver a incluir un objeto excluido en el análisis. Para guardar las anotaciones realizadas durante la anotación del guión gráfico, haga clic en el botón Guardar. Haga clic con el botón izquierdo una vez en cualquier objeto del guión gráfico para abrir una nueva ventana que muestra información detallada de series temporales sobre ese objeto.Para anotar manualmente los tiempos de muerte, haga clic con el botón izquierdo en la barra inferior en el punto correspondiente al momento de la muerte. Use la barra espaciadora y las flechas derecha o izquierda del teclado para moverse a través de los marcos de tiempo o haga clic directamente en la barra en el período de tiempo deseado. Anote manualmente los eventos de contracción y expansión haciendo clic con el botón derecho en la barra inferior en el período de tiempo deseado.Vea las curvas de supervivencia en el lado izquierdo y el diagrama de dispersión que compara el tiempo de cese del movimiento vigoroso con el momento de la muerte de cada individuo en el lado derecho del guión gráfico. Para generar los tiempos de muerte de un experimento, en el navegador de gusanos, seleccione archivos de datos, tiempos de muerte y, a continuación, haga clic en generar tiempos de muerte para el experimento actual. Aquí se muestra el efecto de la validación manual de los datos en las curvas de supervivencia.Las curvas de supervivencia iniciales producidas antes de la anotación del guión gráfico se distorsionaron por la inclusión incorrecta de los objetos que no eran gusanos. Después de excluir objetos que no eran gusanos durante la anotación manual del guión gráfico, las curvas de supervivencia resultantes mostraron una resolución significativamente mejorada. La representación gráfica muestra la vida útil media restante estimada en diferentes etapas del análisis posterior a la adquisición de imágenes y su correlación con la vida útil de los gusanos.Se encontró que la anotación manual de los tiempos de muerte en el análisis del envejecimiento conductual es especialmente importante en gusanos de vida más larga. En este caso, los expuestos a las concentraciones más bajas de bueyes. En conclusión, la estimación automatizada del tiempo de muerte de la máquina de vida útil es lo suficientemente precisa para los ensayos de supervivencia.Mientras que los ensayos de envejecimiento conductual pueden beneficiarse de la anotación manual.

Research

JoVE Journal

Biology

Lifespan Machine Experiment Preparation and Setup for Lifespan and Behavioral Aging Assays on Caenorhabditis elegans

High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine

Genetically identical animals kept in a constant environment display a wide distribution of lifespans, reflecting a large non-genetic, stochastic aspect ...