Name: Identification of Limbal Niche Cells (LNCs)
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00
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identification of limbal niche cells (lncs)

Un protocole pour isoler, cultiver et identifier les cellules de niche limbaire humaines

The incidence of corneal epithelial stem cell deficiency (CESD), also called limbal stem cells deficiency (LSCD)1, and&#160;corneal epithelial regeneration (CES) are&#160;becoming more and more urgent because of corneal infection&#160;and injury. If not properly treated, CESD can lead to blindness that requires corneal transplantation. As a result, CES regeneration is&#160;becoming more significant. There is a group of supportive cells called limbal niche cells (LNCs) that provide essential support for CES function. Limbal stromal stem cells were first isolated by Polisetty et al.2 and identified by Xie et al.3&#160;as LNCs which are localized in the limbal epithelium subjacent and stroma of the limbus. LNCs are the key supporting stem cell of the corneal rim&#160;and, with the function of bone marrow-derived MSC (BMMSCs), and could&#160;be induced to develop into corneal epithelial cells and corneal stromal cells, etc.3,4,5,6,7. Previous studies showed that the stem-cell qualities of LNCs are more primitive than BMMSCs8, which is already widely used in the clinic. LNCs may even become the next viable option after MSC, especially for treating CESD. As important supporting cells for CES, LNCs are also stem cells derived from the &#34;niche&#34; structure of the limbus. LNCs may play a key role in the dedifferentiation of mature corneal epithelial cells (MCEC) to CES9. However, studies on LNCs are still relatively insufficient, and there is no consensus on the terminology, isolation, purification, identification, and characteristics of LNCs. Some researchers have named LNCs limbal biopsy-derived stromal stem cells10, limbal mesenchymal stem cells11, limbal fibroblast stem cells12, and limbal mesenchymal stromal cells13. As the growth characteristics of LNCs have not been described in detail, and because of their promising scientific and clinical applications, and may be one of the most important clinical tools in the future, it is necessary to summarize the isolation, purification, identification, and characteristics of LNCs.
According to a previous study14, LNCs are mainly present at the limbal epithelium subjacent and stroma of the limbus. This protocol includes treating limbus tissue using collagenase A, obtaining a cluster consisting of LEPC and LNCs, and digesting it into single cells with 0.25% trypsin-EDTA (TE). LNCs were then selectively cultured in a modified embryonic stem cell medium (MESCM) to be purified. The protocol reported in this paper is simple and has high efficiency in obtaining human LNCs in large quantities.
The&#160;detailed procedure of LNC isolation, culture, and identification was recorded in the video for scientists who are interested in LNC&#160;study, and it can be conveniently repeated when needed.

Pleins feux sur l’auteur : Normalisation de l’isolement et de la caractérisation des cellules de niche limbique (LNC) pour soutenir la recherche à grande échelle sur les LNC 

Isolement et identification des cellules de niche limbique

Our studies focus on the reconstruction of the limbal niche to treat limbal stem cell deficiency and to restore the patient's vision. We are trying to answer whether or not limbal niche cells are the key cells supporting the function of limbal stem cells, and if so, how it works. Recent studies reported that subconjunctival transplantation of mesenchymal stem cells from bone marrow prevented the limbal stem cell deficiency of alkali-burned eyes.One of the technologies currently used to advance our research is single cell sequencing, which can analyze the key signaling pathway activities at a single cell level for limbal niche cell characterizing. Although LNC have the potential to become an important clinical tool in the future, their growth characteristics have not been explored in much details. Considering their promising scientific and clinical applications, it is necessary to summarize the isolation, purification, identification, and characteristics of LNC.

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Identification of Limbal Niche Cells (LNCs)  

Identification des cellules de niche limbique (LNC)

Pour identifier les cellules de niche limbique ou LNC par coloration par immunofluorescence, ajouter 1 millilitre d’EDTA à 0,25 % de trypsine par puits aux LNC cultivés dans une plaque à 6 puits recouverte de 5 % de matrigel. Digérez les cellules en incubant la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Désaltérez la digestion en ajoutant 1 millilitre de sérum knockout contenant du MESCM à la suspension cellulaire.Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et centrifugez-la à 200 g pendant cinq minutes avant d’aspirer soigneusement le surnageant. Remettre le granulé en suspension dans un millilitre de MESCM. Ensuite, à l’aide d’un cytofuge, déposez 80 microlitres de la suspension cellulaire de manière égale sur quatre lames de microscope selon les instructions du fabricant.Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant environ 10 minutes. Ensuite, perméabilisez les cellules sur les lames en utilisant 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 minutes. Bloquez les cellules avec de l’albumine sérique bovine à 2 % pendant une heure avant de les incuber avec des anticorps primaires sur un agitateur pendant une nuit à 4 degrés Celsius.Après l’incubation, éliminez les anticorps non liés en lavant les lames avec PBST trois fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, incubez l’échantillon avec des anticorps secondaires appropriés à 37 degrés Celsius pendant une heure avant de laver les anticorps non liés comme démontré précédemment. Contre-colorer les noyaux avec du DAPI ayant une concentration de 5 microgrammes par millilitre.Après avoir scellé les lames, effectuez une imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence. À l’aide d’un kit d’isolement de l’ARN, extrayez l’ARN total des LNC selon les instructions du fabricant. Ensuite, à l’aide d’un kit de transcription d’ADN complémentaire ou d’ADNC de grande capacité, transcrivez inversement 1 à 2 microgrammes de l’ARN.Préparez une solution de 20 microlitres contenant 2,5 microlitres d’ADNC, 0,8 microlitre d’amorce génétique correspondante, 10 microlitres d’un mélange maître PCR universel et 6,7 microlitres d’eau double distillée. Effectuez ensuite une réaction en chaîne par polymérase quantitative en utilisant les conditions appropriées. Enfin, utilisez la technique comparative de la tomodensitométrie pour examiner l’expression relative des gènes.La double immuno-coloration des LNC du quatrième passage a clairement révélé que ces cellules étaient systématiquement panCK négatives, VIM positives, CD90 positives, CD105 positives, SCF positives et PDGFR positives.

Research

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Medicine

Identification of Limbal Niche Cells (LNCs)

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...