Isolierung normoxischer und hypoxischer humaner Plazenta-abgeleiteter kleiner extrazellulärer Vesikel zur Injektion in Mäuse

Um mit der Entnahme von Explantaten der menschlichen Plazentaprobe zu beginnen, entfernen Sie die Gerinnsel vorsichtig mit einer sterilisierten Pinzette von der Basalplatte der Plazenta. Extrahieren Sie kleine Explantate, bis eine endgültige Gewebeextraktion von etwa 10 Gramm erreicht ist. Nach dem Waschen und Resuspendieren der Explantate in Nährmedien teilen Sie die resuspendierten Explantate in zwei 100-Millimeter-Kulturschalen auf.

Stellen Sie eines der Gerichte unter normoxischen Standardbedingungen bei 37 Grad Celsius mit 8 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid auf. Die andere Schale in eine hypoxische Kammer mit 1%igem Sauerstoff stellen. Nachdem Sie die Explantaten 18 Stunden lang unter zwei verschiedenen Bedingungen kultiviert haben, ernten Sie die konditionierten Medien der Explantate in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Sammeln Sie die Nährmedien aus den normoxischen und hypoxischen Explantatskulturen in separaten Röhrchen. Führen Sie eine sequenzielle Zentrifugation des geernteten konditionierten Mediums bei Raumtemperatur durch. Nach jeder Zentrifugation wird der Überstand mit einer 20- bis 100-Mikroliter-Pipette vorsichtig aufgefangen und das Pellet entsorgt.

Führen Sie eine zusätzliche Zentrifugation am zuletzt gesammelten Überstand durch. Resuspendieren Sie das erhaltene Pellet mit Plazenta, kleinen extrazellulären Vesikeln oder SEVs in 500 Mikroliter PBS und lassen Sie die Suspension durch einen 0,22-Mikron-Filter leiten. Die aus der Plazenta gewonnenen SEVs können nun in die Maus injiziert werden.