BBB Bozulmasını İncelemek için İnsan Plasenta Kaynaklı Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Farelere Enjekte Edilmesi

Fareye küçük hücre dışı veziküller veya SEV enjeksiyonları yapmak için, hipoksik ve normoksik koşullar altında kültürlenmiş insan plasental eksplantlarından izole edilen SEV'leri kullanın. 200 mikrogram plasental SEV'i fosfat tamponunda pH 7.4'te, 70 mikrolitrelik bir son hacme kadar seyreltin. Enjeksiyondan önce, RMCBS ölçeğini kullanarak hayvanın refahını değerlendirin.

Daha sonra, 30 gauge iğneli bir insülin şırıngası kullanarak, çözeltiyi uygun şekilde uyuşturulmuş farenin dış juguler venine enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen bölgeye kuru bir pamuklu çubukla 15 saniye boyunca hafif basınç uygulayın. Enjeksiyondan üç, altı, 12 ve 24 saat sonra RMCBS ölçeğini kullanarak fare sağlığını değerlendirin.

Evans mavi ekstravazasyonunun analizi için, PBS'de% 2 Evans mavi boya çözeltisi hazırlayın. Retro-orbital erişim kullanarak SEV'leri enjekte ettikten 24 saat sonra, Evans mavi solüsyonunu uygun şekilde anestezi uygulanmış fareye enjekte edin. Evans mavisi hayvan vücudunda dolaştırıldıktan sonra, boyayı dolaşımdan çıkarmak için anestezi uygulanmış fare üzerinde yaklaşık üç mililitre salin solüsyonu ile intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin.

Fareyi BBS'de% 4 paraformaldehit intrakardiyal infüzyonu ile sabitledikten ve beyni dikkatlice çıkardıktan sonra, tartın ve fotoğrafını çekin. Gösterilen prosedürü takiben, her gruptaki hayvanlardan beyinleri çıkarın. Bir stereo zoom mikroskobu kullanarak, kesilen beyin dilimlerinin yakalama görüntülerini görselleştirin.

ImageJ yazılımını kullanarak Evans mavisi ekstravazasyonunu ölçmek için yakalanan görüntüleri kullanın. Normozik plasentalardan SEV enjekte edilen farelerin aksine, hipoksik plasentalardan SEV enjekte edilen fareler, enjeksiyondan 24 saat sonrasına kadar nörolojik skorda ilerleyici bir düşüş gösterdi. Hipoksik plasentalardan SEV enjekte edilen farelerden alınan beyinler, normoksik plasentalardan SEV enjekte edilen hayvanlardan alınan beyinlerden daha yüksek Evans mavisi ekstravazasyonuna sahipti.

Hipoksik plasentalardan SEV enjekte edilen farelerin beyinleri, kan-beyin bariyerinin sıkılığı için kritik olan CLDN5 proteininin azaldığını gösterdi. Tüm bu sonuçlar, hipoksik plasentalardan SEV'ler tarafından sokulan kan-beyin bariyerinin bozulmasını gösterdi.