首先制备含有脂质和洗涤剂的 10% bicelle 储备溶液。为此,取预先干燥的脂质,即 5 摩尔百分比胆固醇和 95 摩尔百分比 DMPC 的混合物,并在其中加入去离子水中的 CHAPSO 洗涤剂溶液。使用水浴超声仪,通过在连续通电下在冰冷的水中超声处理脂质洗涤剂混合物,使其重悬,直到溶液澄清。
然后借助 0.2 微米离心过滤器,去除任何未溶解的成分。接下来,在冰上工作,将所得的bicelle储备溶液与预先制备的蛋白质样品以1比4的体积比混合。将蛋白质二烯混合物在冰上孵育 30 分钟。
对于结晶,在48孔板中将0.5或1微升的蛋白质二烯混合物与等体积的结晶储液库溶液混合。然后使用 48 孔板在悬挂式液滴蒸气扩散模式下设置结晶,并在 20 摄氏度下孵育结晶装置。第二天,检查结晶托盘,确保盖玻片密封正确。
每天至少使用配备偏光片的台式体视显微镜检查晶体生长一次。最后,将蛋白质晶体浸泡在 0.2 摩尔苹果酸钠中,并使用液氮将它们快速冷冻在 50 或 100 微米的冷冻环中。适合数据收集的成熟晶体通常在一到两周内出现,尺寸通常为 50 微米 x 100 微米 x 2 微米。