首先,使用培养箱和 LED 微孔板照明器创建一个用于控制光照和温度的灯箱。然后,在培养箱的上层架子上放置一个六孔板,并检查光束是否均匀地包围它。使用一张纸可视化光覆盖率的分布。
使用测光表测量辐照度和空间均匀性。至少在注射前一天,制作注射皿和琼脂糖包被的六孔板。用胚胎培养基冲洗注射皿模具,然后轻轻放在蜕皮和琼脂糖上。
琼脂糖凝固后,小心翼翼地使用标签去除霉菌。接下来,准备用于脱氯胚胎免疫荧光实验的火焰玻璃移液器。将玻璃移液管的末端放入面包和燃烧器火焰中,并不断旋转,直到边缘变得光滑。
使用此处所示的mRNA制备进样混合物。对于表型测定,在单细胞阶段将针头通过corion直接引入细胞中心,并注入一纳升注射混合物。如果进行免疫荧光测定,则在一个细胞阶段靶向包被胚胎的细胞中心。
对于这两种测定,为未暴露的未注射、未暴露的注射、暴露的未注射和暴露的注射胚胎准备足够的胚胎。每种情况至少选择30个胚胎。对于免疫荧光测定,准备一个含有未注射胚胎的额外培养皿作为替代物,以评估发育阶段的进展。
注射后,将胚胎在28摄氏度的培养皿中孵育。