Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos

כדי להתחיל, השתמש באינקובטור וב- LED Microplate Illuminator כדי ליצור קופסת אור לשליטה בחשיפה לאור ובטמפרטורה. לאחר מכן, הניחו צלחת שש בארות על המדף העליון של האינקובטור, ובדקו אם קרן האור מקיפה אותה באופן שווה. השתמש בגיליון נייר כדי להמחיש את התפלגות כיסוי האור.

השתמש במד אור כדי למדוד קרינה ואחידות מרחבית. לפחות יום לפני ההזרקות, הכינו כלי הזרקה ושש צלחות באר מצופות אגרוז. שוטפים תבנית כלי הזרקה בתווך עוברי, ומניחים בעדינות על מותך ואגרוז.

לאחר שהאגרוז התמצק, השתמשו בעדינות בלשונית כדי להסיר את התבנית. לאחר מכן, הכינו פיפטות זכוכית בוערות לניסויים אימונופלואורסצנטיים על עוברים נטולי כלור. מניחים את קצה פיפטת הזכוכית לתוך לחמנייה ולהבת מבער, ומסובבים ברציפות עד שהקצוות הופכים חלקים.

הכינו תערובת הזרקה באמצעות ה-mRNA המוצג כאן. עבור בדיקת הפנוטיפ, הכנס את המחט דרך הקוריון ישירות למרכז התא בשלב התא האחד, והזריק ננוליטר אחד של תערובת ההזרקה. אם אתם מבצעים בדיקת אימונופלואורסנציה, התמקדו במרכז התא של עוברים מצופים בשלב התא האחד.

עבור שתי הבדיקות, הכינו מספיק עוברים לעוברים שלא נחשפו שלא הוזרקו, לא נחשפו, לא הוזרקו ולא הוזרקו חשופים. בחר לפחות 30 עוברים בכל מצב. עבור בדיקת immunofluorescence, להכין צלחת נוספת המכילה עוברים שאינם מוזרקים כמו proxy כדי להעריך את ההתקדמות של שלבי התפתחות.

לאחר ההזרקה, לדגור על העוברים בצלחות פטרי ב 28 מעלות צלזיוס.