Per iniziare, usa un'incubatrice e un illuminatore per micropiastre a LED per creare una scatola luminosa per controllare l'esposizione alla luce e la temperatura. Quindi, posizionare una piastra a sei pozzetti sul ripiano superiore dell'incubatrice e controllare se il fascio di luce lo avvolge in modo uniforme. Utilizzare un foglio di carta per visualizzare la distribuzione della copertura luminosa.
Utilizzare un esposimetro per misurare l'irraggiamento e l'uniformità spaziale. Almeno un giorno prima delle iniezioni, preparare piatti per iniezione e piastre a sei pozzetti rivestite di agarosio. Sciacquare uno stampo per piatti a iniezione con terreno embrionale e posizionarlo delicatamente sulla muta e sull'agarosio.
Una volta che l'agarosio si è solidificato, utilizzare delicatamente la linguetta per rimuovere lo stampo. Successivamente, preparare pipette di vetro fiammato per esperimenti di immunofluorescenza su embrioni declorurati. Mettere l'estremità di una pipetta di vetro in un panino e bruciare la fiamma e ruotare continuamente fino a quando i bordi non diventano lisci.
Preparare una miscela iniettabile utilizzando gli mRNA mostrati qui. Per il test di fenotipizzazione, introdurre l'ago attraverso il corion direttamente al centro della cellula allo stadio di una cellula e iniettare un nanolitro della miscela di iniezione. Se si esegue un test di immunofluorescenza, mirare al centro della cellula degli embrioni rivestiti allo stadio di una cellula.
Per entrambi i saggi, preparare un numero sufficiente di embrioni per gli embrioni non esposti non iniettati, iniettati non esposti, esposti non iniettati ed esposti iniettati. Selezionare almeno 30 embrioni per condizione. Per il test di immunofluorescenza, preparare un piatto aggiuntivo contenente embrioni non iniettati come proxy per valutare la progressione delle fasi di sviluppo.
Dopo l'iniezione, incubare gli embrioni in piastre di Petri a 28 gradi Celsius.
