Para comenzar, incubar los embriones de pez cebra inyectados a 28 grados centígrados. Alrededor de 1,5 HPF en la etapa de cuatro a 16 células, eliminan los embriones no fertilizados y no saludables. Para el ensayo de fenotipado, envuelva la placa de control no expuesta con embriones no inyectados e inyectados en papel de aluminio.
Coloque la placa cubierta con papel de aluminio en el estante inferior y la placa expuesta en el estante superior de la caja de luz de 28 grados centígrados. Después de confirmar que la cubierta del plato está en su lugar, active la luz azul y cierre la puerta de la caja de luz para evitar la exposición involuntaria a la luz de la habitación. Para el ensayo de inmunofluorescencia de alrededor de 1,5 HPF, envuelva individualmente las placas expuestas y no expuestas en papel de aluminio mientras mantiene la placa proxy sin envolver.
Coloque todos los platos en la caja de luz de 28 grados centígrados sin activar el LED. Cierre la puerta de la caja de luz para evitar la exposición inadvertida a la luz de la habitación. Aproximadamente a los cinco HPF, utilice un endoscopio de disección para evaluar la etapa de desarrollo de los embriones proxy.
También retire los platos envueltos para garantizar una exposición uniforme a la temperatura en todos los platos. Una vez que los embriones proxy alcancen el 40% de epibolia, destape el plato expuesto y colóquelo en el estante superior de la caja de luz. Mantenga el plato sin exponer cubierto en el estante inferior.
Active inmediatamente la luz azul, cierre la puerta y programe un temporizador durante 20 minutos. Para prepararse para la fijación, elimine la mayor cantidad posible de luz ambiental. Justo antes de la fijación, tome tubos que contengan un 4% de formaldehído a cuatro grados centígrados y colóquelos al lado de la caja de luz.
Después de 20 minutos, abra la puerta de la caja de luz y retire el plato que no estuvo expuesto a la luz. Utilice una punta de pipeta de vidrio flameado para extraer los embriones sensibles a la luz de la placa. Luego, para sumergir los embriones en formaldehído al 4%, sumerja la punta de la pipeta de vidrio flameado en el formaldehído y deje que los embriones se hundan en el líquido.
Almacenar embriones fijos a cuatro grados centígrados durante la noche.
