在培养饲养层细胞近一小时后,继续进行原代人肝细胞或PHH的铺板。为此,在饲养层细胞培养 30 分钟后,通过 0.2 微米聚醚砜过滤单元过滤预热的肝细胞解冻培养基。在 37 摄氏度的水浴中解冻 PHH 一到两分钟。
解冻后,立即将解冻的细胞放在冰上。然后,在生物安全柜中工作,将细胞转移到肝细胞解冻培养基中。使用 1, 000 微升移液管,将解冻培养基中的一毫升肝细胞悬浮液转移回小瓶中,并通过轻柔移液洗涤小瓶三到四次。
将洗涤液与管中其余的细胞悬浮液混合,盖上盖,并轻轻倒置解冻的PHH悬浮液五次。在室温下以 100 G 旋转 8 分钟。通过真空抽吸或移液小心地弃去上清液,而不会干扰细胞沉淀。
然后在含有颗粒的锥形管壁上加入三毫升完全电镀介质。左右摇晃锥形管以重悬细胞沉淀,并加入五毫升完全电镀介质。计数重悬的肝细胞后,使用完全接种培养基将细胞悬液调整至所需的接种密度。
接下来,获得含有先前接种的饲养层细胞的胶原包被的24孔板,并使用移液管或真空抽吸,从饲养层细胞中除去培养基。立即将 500 μL 稀释的肝细胞悬浮液铺入每个含有饲养细胞的孔中。通过在南北方向来回运动两次,然后在东西方向上进行相同的运动,以南北向、东西向的运动来摇晃板块。
将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育两到四个小时。在培养的前 60 分钟,如前所述,每 15 分钟摇晃一次培养板。孵育后,将板从培养箱转移到生物安全柜中。
摇动板后,使用移液或真空吸液除去完整的镀层介质。立即向每个孔中加入 500 微升预热的完全培养基。在培养的第 7 天和第 14 天获得来自以不同接种密度培养的饲养细胞培养的两名供体的 PHH 图像。
不同播种密度均呈现出汇合的视觉差异,但保持了典型的肝立方体形态。