Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice

まず、中枢神経系組織を解離した後に細胞ペレットを採取し、1本の15ミリリットルのチューブに3, 100マイクロリットルのDPBSで再懸濁します。ボルテックスしないでください。成人の脳解離キットから1, 800マイクロリットルの破片除去溶液を、プールされた2つのCNS細胞懸濁液に加えます。

チューブをひっくり返して懸濁液を混合し、4ミリリットルの冷たいDPBSを静かに重ね合わせ、明確なグラジエントを観察します。チューブを 3 、 000 g 、摂氏 4 度で 10 分間遠心分離し、全加速で中断しません。遠心分離後、3つの相が形成されます。

上部の2つの相を完全に吸引して廃棄し、ミエリン残渣が残らないようにします。チューブに最大14ミリリットルの冷たいDPBSを充填し、閉じます。セルペレットがチューブの底から外れるまで、作業台の上でチューブを力を入れて反転させます。

サンプルを遠心分離し、上清を完全に吸引します。赤血球除去の場合は、細胞ペレットに1ミリリットルの赤血球除去溶液を加えます。ペレットを再懸濁した後、溶液を摂氏4度で10分間インキュベートします。

次に、10 mLの冷たいPB緩衝液を添加し、サンプルを遠心分離し、上清を完全に吸引します。細胞カウントの場合は、細胞懸濁液をPBバッファーで50倍に希釈し、次に0.4%トリパンブルー溶液で1〜10倍希釈します。次に、改良された計数チャンバーを使用して、細胞数を決定します。