For å begynne, oppnå en cellepellet etter dissosiasjon av CNS-vev og suspendere den med 3.100 mikroliter DPBS i ett 15 milliliter rør. Ikke virvel. Legg til 1.800 mikroliter av ruskfjerningsløsningen fra det voksne hjernedissosiasjonssettet til to samlede CNS-cellesuspensjoner.
Inverter røret og bland suspensjonen, legg den forsiktig over med 4 ml kald DPBS og følg en klar gradient. Sentrifuge rørene i 10 minutter ved 3.000g ved 4 grader Celsius med full akselerasjon og ingen pause. Etter sentrifugering dannes tre faser.
Aspirer de to øverste fasene helt og kast dem, slik at ingen myelinrester blir etterlatt. Fyll opp røret med kalde DPBS opp til 14 milliliter og lukk det. Snu røret med kraft på arbeidsbenken til cellepelleten løsner fra bunnen av røret.
Sentrifuger prøven og aspirer supernatanten helt. For fjerning av røde blodlegemer, tilsett 1 milliliter av løsningen for fjerning av røde blodlegemer til cellepelleten. Etter re-suspendering av pelleten, inkuber løsningen i 10 minutter ved 4 grader Celsius.
Deretter tilsettes 10 ml kald PB-buffer, sentrifugerer prøven og aspirerer supernatanten helt. For celletelling, fortynn cellesuspensjonen med 50 ganger i PB-bufferen og deretter med 1 til 10 fortynning i 0,4 % Trypan Blue-oppløsning. Deretter bestemmer du celletallet ved hjelp av et forbedret tellekammer.