Name: Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
Uploaded: 2023-10-27T12:30:00
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plating cfse-labelled tumor cells and co-culturing car-expressing jurkats for in vitro cytotoxicity evaluation

Évaluation quantitative de la destruction des cellules tumorales par des cellules Jurkat exprimant des CAR.

CAR-T cell therapy has shown great promise in hematological malignancies, evident from the 6 FDA-approved CAR-T products since 2017, as reported by the National Cancer Institute1. There are numerous CAR-T cells in clinical trials for targeting solid tumors. Engineering novel CAR targets and optimizing the CAR construct is vital to the efficacy of a CAR-T cell. Choosing the ideal CAR construct for each application is essential for accurate targeting of tumor associated antigens (TAA) while avoiding low levels of TAA expression in normal tissues2.
A CAR construct is primarily made of five compartments: (1) extracellular single-chain variable fragment (scFv) domain targeting tumor antigen; (2) hinge domain; (3) transmembrane domain; (4) intracellular cytoplasmic T cell costimulatory domain; and (5) signaling domain. Modifying each of these domains affects the precision of the CAR-T cell engaging with its target cell3. Hence, evaluating the cytotoxicity and cross-reactivity of these CAR constructs in vitro is critical to choose the right construct for progressing toward in vivo experiments. Current methods of evaluating cytolysis by T cells include 51Cr release assay, lactate dehydrogenase release assay, bioluminescent imaging assay, real-time impedance-based cell analysis, and cell-based flow cytometry assay4,5. The fluorescent imaging-based platform described here identifies the number of live vs. dead cells, which is a direct quantification of T cell cytolysis as opposed to an indirect method of evaluating the cytolysis by T cells.
Here is an easy, cost-efficient, rapid, and high throughput technique with minimal intervention to evaluate the cytotoxicity of Jurkat cells expressing epidermal growth factor receptor (EGFR) CAR against MDA-MB-231 triple-negative breast cancer (TNBC) cells and EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 cells. Jurkat cells are immortalized human T Lymphocyte Cells6 that have been widely used for studying T cell activation and signaling mechanisms7. Furthermore, Jurkat cells have been used for in vitro CAR testing in multiple studies8,9,10,11. Jurkat cells are easily transduced by lentivirus and have sustained proliferation, and this system was leveraged to optimize the hinge domain of various EGFR CAR constructs.
This assay can be used for screening multiple CAR constructs targeting various tumor antigens and used against multiple adherent tumor cell lines and in various effector to tumor (E:T) ratios. Additionally, multiple time points can be evaluated, and number of replicates can be modified to identify best killing among the various CAR constructs. The best constructs need to be confirmed using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived CD3 T cells. The overall goal behind developing this method is to rapidly optimize CAR hinge geometry in a high throughput manner overcoming barriers such as low transduction efficiency, followed by confirmation in PBMC derived T cells.

Pleins feux sur l’auteur : Criblage à haut débit de constructions de cellules CAR-T pour une cytotoxicité et une mémoire immunologique améliorées 

Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente

CAR T-cells are being constantly improved to achieve better responses in human clinical trials. We are identifying ways to evaluate this in our lab using an unbiased high throughput method, such as using fluorescent imaging to screen combinations that work best. There are several combinations of constructs that can be designed for any single chain variable fragment by modifying the geometry of the extracellular and hinge domains.We have designed this protocol to identify the combinations with the best efficacy in eliminating target cells using Jurkat cells. This is a rapid, high throughput protocol to screen CAR constructs based on its target cell cytotoxicity using Jurkat cells, which are then validated with conventional T-cells. A dozen different CAR constructs can be tested in a 96-well plate simultaneously using this technique.Here in Akhavan Lab, we quantify in absolute numbers the direct cyclosis of target cells by the CAR expressing Jurkat cells in a high throughput manner to screen multiple CAR constructs. Our laboratory's primary aim is to improve the clinical translation of CAR T-cell therapy against high grade brain tumors. We leverage high throughput drug screens as one modality to improve CAR T-cell cytotoxicity, as well as targeting the tumor microenvironment.

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Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation  

Placage de cellules tumorales marquées au CFSE et co-culture de jurkats exprimant des CAR pour l’évaluation de la cytotoxicité in vitro

Pour commencer à utiliser une pipette sérologique, retirez le milieu de culture du flacon T75 contenant 70 % de culture confluente MDA-MB-231. Ajoutez trois millilitres de trypsine dans le flacon et incubez à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois à cinq minutes pour détacher les cellules du flacon. Ensuite, pour neutraliser la trypsine, ajoutez trois millilitres de DMEM dans le flacon.Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et essorer à 400 G pendant quatre minutes. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de PBS. À l’aide d’un compteur de cellules, déterminez la concentration cellulaire.Transférez huit fois 10 à la cinquième cellule dans un tube de 15 millilitres et ajoutez du PBS pour que le volume atteigne un millilitre. Ajoutez ensuite deux microlitres de CFSE dans le tube et mélangez soigneusement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Placez le tube à 37 degrés Celsius et incubateur à 5% de dioxyde de carbone pendant 20 minutes.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DMEM dans le tube et centrifugez pour agglomérer les cellules marquées CFSE. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de DMEM. Après avoir réévalué la concentration cellulaire, transférez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules dans un réservoir de réactif de 25 millilitres.Ajoutez du DMEM pour obtenir un volume de huit millilitres et mélangez la suspension cellulaire avec une pipette sérologique de cinq millilitres. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque rangée de la moitié gauche d’une plaque noire à 96 puits. De même, ajoutez la suspension de la cellule défonçable EGFR sur la moitié droite de la plaque.Pour assurer une distribution uniforme des cellules, déplacez la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre sur la plate-forme. Incubez la plaque pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour que les cellules tumorales se fixent. Sur la base du nombre de cellules Jurkat non transduites et exprimant le CAR, transférez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules CAR-J dans un réservoir de 25 millilitres.Ajouter le DMEM dans le réservoir jusqu’à obtenir un volume final de deux millilitres. Pour un rapport effecteur/tumeur de 4 :1, ajoutez deux fois 10 aux quatrièmes cellules CAR-J par puits dans 100 microlitres de milieu le long du côté du puits sans perturber les cellules tumorales attachées. Ajoutez ensuite 100 microlitres de DMEM sur le côté des puits contenant des cellules tumorales et Jurkat pour obtenir 300 microlitres de volume par puits.Déplacez la plaque comme démontré pour assurer une distribution uniforme des cellules de Jurkat sur les cellules tumorales. Laissez la co-culture s’établir à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR-Jurkat Co-Culture with CFSE-Labeled Tumor Cells

Préparation d’une plaque pour l’imagerie fluorescente et l’évaluation de la viabilité cellulaire en co-culture CAR-Jurkat avec des cellules tumorales marquées CFSE