Name: Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
Uploaded: 2023-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation at JoVE.com

plating cfse-labelled tumor cells and co-culturing car-expressing jurkats for in vitro cytotoxicity evaluation

Utvärdering av kvantitativ avdödning av tumörceller med CAR-uttryckande Jurkat-celler

CAR-T cell therapy has shown great promise in hematological malignancies, evident from the 6 FDA-approved CAR-T products since 2017, as reported by the National Cancer Institute1. There are numerous CAR-T cells in clinical trials for targeting solid tumors. Engineering novel CAR targets and optimizing the CAR construct is vital to the efficacy of a CAR-T cell. Choosing the ideal CAR construct for each application is essential for accurate targeting of tumor associated antigens (TAA) while avoiding low levels of TAA expression in normal tissues2.
A CAR construct is primarily made of five compartments: (1) extracellular single-chain variable fragment (scFv) domain targeting tumor antigen; (2) hinge domain; (3) transmembrane domain; (4) intracellular cytoplasmic T cell costimulatory domain; and (5) signaling domain. Modifying each of these domains affects the precision of the CAR-T cell engaging with its target cell3. Hence, evaluating the cytotoxicity and cross-reactivity of these CAR constructs in vitro is critical to choose the right construct for progressing toward in vivo experiments. Current methods of evaluating cytolysis by T cells include 51Cr release assay, lactate dehydrogenase release assay, bioluminescent imaging assay, real-time impedance-based cell analysis, and cell-based flow cytometry assay4,5. The fluorescent imaging-based platform described here identifies the number of live vs. dead cells, which is a direct quantification of T cell cytolysis as opposed to an indirect method of evaluating the cytolysis by T cells.
Here is an easy, cost-efficient, rapid, and high throughput technique with minimal intervention to evaluate the cytotoxicity of Jurkat cells expressing epidermal growth factor receptor (EGFR) CAR against MDA-MB-231 triple-negative breast cancer (TNBC) cells and EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 cells. Jurkat cells are immortalized human T Lymphocyte Cells6 that have been widely used for studying T cell activation and signaling mechanisms7. Furthermore, Jurkat cells have been used for in vitro CAR testing in multiple studies8,9,10,11. Jurkat cells are easily transduced by lentivirus and have sustained proliferation, and this system was leveraged to optimize the hinge domain of various EGFR CAR constructs.
This assay can be used for screening multiple CAR constructs targeting various tumor antigens and used against multiple adherent tumor cell lines and in various effector to tumor (E:T) ratios. Additionally, multiple time points can be evaluated, and number of replicates can be modified to identify best killing among the various CAR constructs. The best constructs need to be confirmed using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived CD3 T cells. The overall goal behind developing this method is to rapidly optimize CAR hinge geometry in a high throughput manner overcoming barriers such as low transduction efficiency, followed by confirmation in PBMC derived T cells.

Författare i fokus: Screening av CAR T-cellskonstruktioner med hög genomströmning för förbättrad cytotoxicitet och immunologiskt minne 

Snabb in vitro cytotoxicitetsutvärdering av Jurkat-uttryckande chimär antigenreceptor med hjälp av fluorescerande avbildning

CAR T-cells are being constantly improved to achieve better responses in human clinical trials. We are identifying ways to evaluate this in our lab using an unbiased high throughput method, such as using fluorescent imaging to screen combinations that work best. There are several combinations of constructs that can be designed for any single chain variable fragment by modifying the geometry of the extracellular and hinge domains.We have designed this protocol to identify the combinations with the best efficacy in eliminating target cells using Jurkat cells. This is a rapid, high throughput protocol to screen CAR constructs based on its target cell cytotoxicity using Jurkat cells, which are then validated with conventional T-cells. A dozen different CAR constructs can be tested in a 96-well plate simultaneously using this technique.Here in Akhavan Lab, we quantify in absolute numbers the direct cyclosis of target cells by the CAR expressing Jurkat cells in a high throughput manner to screen multiple CAR constructs. Our laboratory's primary aim is to improve the clinical translation of CAR T-cell therapy against high grade brain tumors. We leverage high throughput drug screens as one modality to improve CAR T-cell cytotoxicity, as well as targeting the tumor microenvironment.

Watch this Scientific Journal Video about Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation at JoVE.com

Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation  

Plätering av CFSE-märkta tumörceller och samodling av CAR-uttryckande jurkater för utvärdering av cytotoxicitet in vitro

För att börja använda en serologisk pipett, avlägsna odlingsmediet från T75-kolven som innehåller 70 % sammanflytande MDA-MB-231-kultur. Tillsätt tre milliliter trypsin i kolven och inkubera vid 37 grader med 5 % koldioxid i tre till fem minuter för att lossa cellerna från kolven. För att neutralisera trypsinet tillsätt sedan tre milliliter DMEM i kolven.Samla upp cellsuspensionen i ett centrifugrör och centrifugera vid 400 G i fyra minuter. Kassera supernatanten med en pipett och återsuspendera pelleten i två milliliter PBS. Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare.Överför åtta gånger 10 till de femte cellerna i ett 15 milliliters rör och tillsätt PBS för att göra volymen till en milliliter. Tillsätt sedan två mikroliter CFSE i röret och blanda cellsuspensionen noggrant med en enmilliliters pipett. Placera röret på 37 grader Celsius och 5% koldioxidinkubator i 20 minuter.Tillsätt sedan fem milliliter DMEM till röret och centrifugera för att pelletera ner de CFSE-märkta cellerna. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i en milliliter DMEM. Efter omvärdering av cellkoncentrationen, överför fyra gånger 10 till de femte cellerna till en 25 ml reagensreservoar.Tillsätt DMEM för att göra volymen åtta milliliter och blanda cellsuspensionen med en fem milliliter serologisk pipett. Använd en flerkanalspipett och överför 100 mikroliter cellsuspension till varje rad på den vänstra halvan av en svart 96-hålsplatta. På samma sätt lägger du till EGFR knockoutcellsuspension på den högra halvan av plattan.För att säkerställa jämn cellfördelning, flytta plattan fram och tillbaka och från sida till sida på plattformen. Inkubera plattan i fyra timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för tumörcellerna att fästa. Baserat på räkning av otransducerade och CAR-uttryckande Jurkat-celler, överför fyra gånger 10 till de femte CAR-J-cellerna till en 25 ml-reservoar.Tillsätt DMEM till behållaren till en slutlig volym på två milliliter. För ett effektor-till-tumör-förhållande på 4:1, tillsätt två gånger 10 till de fjärde CAR-J-cellerna per brunn i 100 mikroliter medium längs sidan av brunnen utan att störa de bifogade tumörcellerna. Tillsätt sedan 100 mikroliter DMEM på sidan av brunnarna som innehåller tumör- och Jurkat-celler för att få 300 mikroliter volym per brunn.Flytta plattan som visas för att säkerställa jämn fördelning av Jurkat-cellerna på tumörcellerna. Låt samkulturen etablera sig vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 48 timmar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...