Name: Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
Uploaded: 2023-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation at JoVE.com

plating cfse-labelled tumor cells and co-culturing car-expressing jurkats for in vitro cytotoxicity evaluation

CAR İfade Eden Jurkat Hücreleri ile Kantitatif Tümör Hücresi Öldürmenin Değerlendirilmesi

CAR-T cell therapy has shown great promise in hematological malignancies, evident from the 6 FDA-approved CAR-T products since 2017, as reported by the National Cancer Institute1. There are numerous CAR-T cells in clinical trials for targeting solid tumors. Engineering novel CAR targets and optimizing the CAR construct is vital to the efficacy of a CAR-T cell. Choosing the ideal CAR construct for each application is essential for accurate targeting of tumor associated antigens (TAA) while avoiding low levels of TAA expression in normal tissues2.
A CAR construct is primarily made of five compartments: (1) extracellular single-chain variable fragment (scFv) domain targeting tumor antigen; (2) hinge domain; (3) transmembrane domain; (4) intracellular cytoplasmic T cell costimulatory domain; and (5) signaling domain. Modifying each of these domains affects the precision of the CAR-T cell engaging with its target cell3. Hence, evaluating the cytotoxicity and cross-reactivity of these CAR constructs in vitro is critical to choose the right construct for progressing toward in vivo experiments. Current methods of evaluating cytolysis by T cells include 51Cr release assay, lactate dehydrogenase release assay, bioluminescent imaging assay, real-time impedance-based cell analysis, and cell-based flow cytometry assay4,5. The fluorescent imaging-based platform described here identifies the number of live vs. dead cells, which is a direct quantification of T cell cytolysis as opposed to an indirect method of evaluating the cytolysis by T cells.
Here is an easy, cost-efficient, rapid, and high throughput technique with minimal intervention to evaluate the cytotoxicity of Jurkat cells expressing epidermal growth factor receptor (EGFR) CAR against MDA-MB-231 triple-negative breast cancer (TNBC) cells and EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 cells. Jurkat cells are immortalized human T Lymphocyte Cells6 that have been widely used for studying T cell activation and signaling mechanisms7. Furthermore, Jurkat cells have been used for in vitro CAR testing in multiple studies8,9,10,11. Jurkat cells are easily transduced by lentivirus and have sustained proliferation, and this system was leveraged to optimize the hinge domain of various EGFR CAR constructs.
This assay can be used for screening multiple CAR constructs targeting various tumor antigens and used against multiple adherent tumor cell lines and in various effector to tumor (E:T) ratios. Additionally, multiple time points can be evaluated, and number of replicates can be modified to identify best killing among the various CAR constructs. The best constructs need to be confirmed using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived CD3 T cells. The overall goal behind developing this method is to rapidly optimize CAR hinge geometry in a high throughput manner overcoming barriers such as low transduction efficiency, followed by confirmation in PBMC derived T cells.

Yazar Spotlight: Gelişmiş sitotoksisite ve immünolojik hafıza için CAR T-hücresi yapılarının yüksek verimli taraması 

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi

CAR T-cells are being constantly improved to achieve better responses in human clinical trials. We are identifying ways to evaluate this in our lab using an unbiased high throughput method, such as using fluorescent imaging to screen combinations that work best. There are several combinations of constructs that can be designed for any single chain variable fragment by modifying the geometry of the extracellular and hinge domains.We have designed this protocol to identify the combinations with the best efficacy in eliminating target cells using Jurkat cells. This is a rapid, high throughput protocol to screen CAR constructs based on its target cell cytotoxicity using Jurkat cells, which are then validated with conventional T-cells. A dozen different CAR constructs can be tested in a 96-well plate simultaneously using this technique.Here in Akhavan Lab, we quantify in absolute numbers the direct cyclosis of target cells by the CAR expressing Jurkat cells in a high throughput manner to screen multiple CAR constructs. Our laboratory's primary aim is to improve the clinical translation of CAR T-cell therapy against high grade brain tumors. We leverage high throughput drug screens as one modality to improve CAR T-cell cytotoxicity, as well as targeting the tumor microenvironment.

Watch this Scientific Journal Video about Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation at JoVE.com

Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation  

İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi için CFSE Etiketli Tümör Hücrelerinin Kaplanması ve CAR-Eksprese Eden Jurkatların Birlikte Kültürlenmesi

Serolojik bir pipet kullanmaya başlamak için, büyüme ortamını %70 birleşik MDA-MB-231 kültürü içeren T75 şişesinden çıkarın. Şişeye üç mililitre tripsin ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için üç ila beş dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 derecede inkübe edin. Daha sonra tripsini nötralize etmek için, şişeye üç mililitre DMEM ekleyin.Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve dört dakika boyunca 400 G'de döndürün. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve peleti iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.Sekiz kez 10'u beşinci hücrelere 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hacmi bir mililitreye çıkarmak için PBS ekleyin. Daha sonra tüpe iki mikrolitre CFSE ekleyin ve bir mililitrelik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu iyice karıştırın. Tüpü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörünü 20 dakika boyunca yerleştirin.Daha sonra, tüpe beş mililitre DMEM ekleyin ve CFSE etiketli hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti bir mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonunu yeniden değerlendirdikten sonra, 25 mililitrelik bir reaktif rezervuarına dört kez 10 ila beşinci hücreye aktarın.Hacmi sekiz mililitre yapmak için DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu beş mililitrelik serolojik pipetle karıştırın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu siyah bir plakanın sol yarısındaki her sıraya 100 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın. Benzer şekilde, plakanın sağ yarısına EGFR nakavt hücresi süspansiyonu ekleyin.Düzgün hücre dağılımını sağlamak için, plakayı platform üzerinde ileri geri ve yan yana hareket ettirin. Tümör hücrelerinin yapışması için plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte dört saat inkübe edin. Transdüklenmemiş ve CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sayımlarına dayanarak, 25 mililitrelik bir rezervuara dört kez 10 ila beşinci CAR-J hücresine aktarın.Rezervuara iki mililitrelik bir son hacme DMEM ekleyin. 4: 1'lik bir efektör-tümör oranı için, bağlı tümör hücrelerini bozmadan, kuyu kenarı boyunca 100 mikrolitre ortamda oyuk başına dördüncü CAR-J hücrelerine iki kez 10 ekleyin. Daha sonra, kuyu başına 300 mikrolitre hacim elde etmek için tümör ve Jurkat hücreleri içeren kuyucukların yanına 100 mikrolitre DMEM ekleyin.Jurkat hücrelerinin tümör hücreleri üzerinde eşit dağılımını sağlamak için plakayı gösterildiği gibi hareket ettirin. Ko-kültürün 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kurulmasına izin verin.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...