Name: طريقة واحدة وخطوتين لعزل العدلات في الفئران لحصاد مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

one and two-step method of rat neutrophil isolation for harvesting neutrophil extracellular traps (nets)

كفاءة الفئران نخاع العظام العدلات خارج الخلية فخ العزل

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

تسليط الضوء على المؤلف: الطريقة المثلى لعزل العدلات الفئران والشبكات من نخاع العظام

نهج فريد لعزل العدلات نخاع عظم الفئران بسعة مماثلة

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

طريقة واحدة وخطوتين لعزل العدلات في الفئران لحصاد مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)

لبدء حصاد نخاع العظم ، انقع فأرا مقترحا في 75٪ إيثانول لتعقيم الفراء والجلد. ضع الجرذ على ظهره واقطع الأطراف السفلية عند الورك لحماية رأس عظم الفخذ. استخدم مقص التشريح لقطع الرباط عند مفصل العرقوب.ثم قم بطي مفصل الركبة للخلف لكشف عظم الفخذ والساق. باستخدام زوج من الملقط والمقص ، قم بإزالة أي عضلات وأوتار وأنسجة أخرى متصلة بالعظام بعناية. كزة النخاع من خلال طرفي العظام باستخدام حقنة إبرة 5 ملم لتخفيف مصفوفة النخاع.الآن استخدم حقنة جديدة لطرد نخاع العظم باستخدام 10-15 ملليلتر من وسائط RPMI. الطرد المركزي خلايا نخاع العظم في 300G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5-10 ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء.بعد احتضان التعليق ، أضف أربعة أضعاف حجم HBSS إلى الخليط. ثم أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم الحبيبات الناتجة لمزيد من الاستخدام.اعزل العدلات أولا باستخدام مجموعة عزل العدلات في نخاع عظم الفئران. طبقة 2 ملليلتر من 80-55 ٪ لكل كاشف العقيد في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر ، لإنشاء تدرج الكثافة. ثم ماصة العدلات المعزولة ، أو محلول إعادة تعليق الخلايا المعزولة مع مجموعة عزل العدلات نخاع عظم الفئران ، في الأنبوب.جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 جرام لمدة 40 دقيقة عند 20 درجة مئوية. باستخدام ماصة معقمة ، اجمع طبقة التدرج 70٪ ، بما في ذلك طبقات الخلايا عند حدود 65-70٪. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد 15 ملليلتر.أضف 15 ملليلترا من HBSS في الأنبوب واقلبه برفق لخلط محتوياته. أخيرا ، قم بطرد الأنبوب عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. بالنسبة للعملية المكونة من خطوة واحدة ، بعد سحب تعليق نخاع العظم مباشرة في أنبوب تدرج الكثافة ، أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.بعد ذلك ، قم بإخراج طبقة التدرج 70٪ ، بما في ذلك الطبقات عند حد التدرج 75-70٪. نقل تعليق الخلية هذا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من HBSS. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 400G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه الخلايا.عد العدلات المعزولة باستخدام مقياس الدم ، وقم بتقييم صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق. كان للطريقة المكونة من خطوتين مستوى نقاء محسن بنسبة 90٪ مقارنة ب 50٪ التي حققتها طريقة الخطوة الواحدة.

Research

JoVE Journal

Biology

One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...