Name: Een- en tweestapsmethode voor het isoleren van neutrofielen bij ratten voor het oogsten van extracellulaire vallen voor neutrofielen (NET's)
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

one and two-step method of rat neutrophil isolation for harvesting neutrophil extracellular traps (nets)

Efficiënte isolatie van de Neutrofiele Extracellulaire Valstrik van het Rat Beenmerg

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

Auteur in de schijnwerpers: geoptimaliseerde methode voor het isoleren van rattenneutrofielen en NET's uit beenmerg

Unieke aanpak voor het isoleren van beenmergneutrofielen bij ratten met vergelijkbare capaciteit

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

Een- en tweestapsmethode voor het isoleren van neutrofielen bij ratten voor het oogsten van extracellulaire vallen voor neutrofielen (NET's)

Om met de beenmergoogst te beginnen, laat u een geëuthanaseerde rat weken in 75% ethanol om de vacht en huid te steriliseren. Leg de rat op zijn rug en snijd de onderste ledematen bij de heup door om de kop van het dijbeen te beschermen. Gebruik een dissectieschaar om het ligament bij het spronggewricht door te knippen.Vouw vervolgens het kniegewricht naar achteren om het dijbeen en het scheenbeen bloot te leggen. Verwijder met een tang en schaar voorzichtig alle spieren, pezen en andere weefsels die met de botten zijn verbonden. Prik het merg door beide botuiteinden met een naaldspuit van 5 millimeter om de mergmatrix los te maken.Gebruik nu een verse spuit om het beenmerg weg te spoelen met 10-15 milliliter RPMI-media. Centrifugeer de beenmergcellen bij 300G gedurende 10 minuten bij 20 graden Celsius. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 5-10 milliliter lysebuffer voor rode bloedcellen.Voeg na het incuberen van de suspensie viermaal het volume HBSS toe aan het mengsel. Centrifugeer de cellen vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur op 600G. Gebruik de resulterende pellet voor verder gebruik.Isoleer de neutrofielen eerst met een neutrofielenisolatiekit voor beenmerg van ratten. Laag 2 milliliter reagens van 80-55% per col in een centrifugebuis van 15 milliliter om een dichtheidsgradiënt te creëren. Vervolgens pipetteer je de geïsoleerde neutrofielen, of de resuspensieoplossing van cellen geïsoleerd met een neutrofielenisolatiekit voor beenmerg van ratten, in de buis.Centrifugeer de buis op 800G gedurende 40 minuten bij 20 graden Celsius. Verzamel met een steriele pipet de 70%-gradiëntlaag, inclusief de cellagen op de 65-70%-grens. Breng de celsuspensie over in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter.Voeg 15 milliliter HBSS toe aan de tube en keer voorzichtig om om de inhoud te mengen. Centrifugeer ten slotte de buis op 300G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Voor het eenstapsproces centrifugeert u na het pipetteren van de beenmergsuspensie rechtstreeks in de dichtheidsgradiëntbuis, zoals eerder gedemonstreerd.Pipetteer vervolgens de 70%-gradiëntlaag, inclusief de lagen op de 75-70%-gradiëntgrens. Breng deze celsuspensie over in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter met 10 milliliter HBSS. Centrifugeer vervolgens de buis op 400G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.Tel de geïsoleerde neutrofielen met behulp van een hemocytometer en beoordeel de levensvatbaarheid van de cel via trypanblauwe kleuring. De tweestapsmethode had een verhoogd zuiverheidsniveau van 90% in vergelijking met de 50% die werd bereikt door de eenstapsmethode.

Research

JoVE Journal

Biology

One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...