Name: Méthode en une et deux étapes d’isolement des neutrophiles chez le rat pour la récolte de pièges extracellulaires à neutrophiles (TNE)
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00
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one and two-step method of rat neutrophil isolation for harvesting neutrophil extracellular traps (nets)

Isolation efficace du piège extracellulaire de neutrophiles de moelle osseuse de rat

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

Pleins feux sur l’auteur : Méthode optimisée pour isoler les neutrophiles et les TNE de rat de la moelle osseuse

Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

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Méthode en une et deux étapes d’isolement des neutrophiles chez le rat pour la récolte de pièges extracellulaires à neutrophiles (TNE)

Pour commencer le prélèvement de moelle osseuse, trempez un rat euthanasié dans de l’éthanol à 75 % pour stériliser la fourrure et la peau. Allongez le rat sur le dos et coupez les membres inférieurs de la hanche pour protéger la tête du fémur. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper le ligament au niveau de l’articulation du jarret.Repliez ensuite l’articulation du genou vers l’arrière pour exposer le fémur et le tibia. Avec une paire de pinces et de ciseaux, retirez soigneusement tous les muscles, tendons et autres tissus connectés aux os. Percez la moelle à travers les deux extrémités des os avec une seringue à aiguille de 5 millimètres pour détacher la matrice de moelle.Utilisez maintenant une seringue fraîche pour rincer la moelle osseuse avec 10 à 15 millilitres de milieu RPMI. Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 300 G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 à 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges.Après avoir incubé la suspension, ajoutez quatre fois le volume de HBSS au mélange. Ensuite, centrifugez les cellules à 600G pendant cinq minutes à température ambiante. Utilisez le granulé obtenu pour une utilisation ultérieure.Isolez d’abord les neutrophiles avec une trousse d’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse du rat. Couche 2 millilitres de réactif 80-55% par colonne dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, pour créer un gradient de densité. Ensuite, pipetez les neutrophiles isolés, ou la solution de remise en suspension des cellules isolées avec le kit d’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse de rat, dans le tube.Centrifugez le tube à 800G pendant 40 minutes à 20 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette stérile, prélevez la couche de gradient de 70 %, y compris les couches cellulaires à la limite de 65 à 70 %. Transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres.Ajoutez 15 millilitres de HBSS dans le tube et retournez doucement pour mélanger son contenu. Enfin, centrifugez le tube à 300G pendant 10 minutes à température ambiante pour granuler les cellules. Pour le processus en une étape, après avoir pipeté la suspension de moelle osseuse directement dans le tube à gradient de densité, centrifuger comme démontré précédemment.Ensuite, pipetez la couche de gradient de 70 %, y compris les couches à la limite du gradient de 75 à 70 %. Transférez cette suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres avec 10 millilitres de HBSS. Ensuite, centrifugez le tube à 400G pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les cellules.Compter les neutrophiles isolés à l’aide d’un hémocytomètre et évaluer la viabilité cellulaire par coloration au bleu trypan. La méthode en deux étapes avait un niveau de pureté amélioré de 90 % par rapport aux 50 % obtenus par la méthode en une étape.

Research

JoVE Journal

Biology

One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...