Name: Ein- und zweistufige Methode zur Isolierung von Rattenneutrophilen zur Ernte von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs)
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00
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one and two-step method of rat neutrophil isolation for harvesting neutrophil extracellular traps (nets)

Effiziente Isolierung von extrazellulären Fallen aus dem Knochenmark von Ratten mit Neutrophilen

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

Autor im Rampenlicht: Optimierte Methode zur Isolierung von Neutrophilen und NETs von Ratten aus dem Knochenmark

Einzigartiger Ansatz zur Isolierung von Neutrophilen im Knochenmark von Ratten mit vergleichbarer Kapazität

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

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Ein- und zweistufige Methode zur Isolierung von Rattenneutrophilen zur Ernte von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs)

Um mit der Knochenmarkentnahme zu beginnen, weichen Sie eine euthanasierte Ratte in 75% Ethanol ein, um das Fell und die Haut zu sterilisieren. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und trennen Sie die unteren Gliedmaßen an der Hüfte ab, um den Oberschenkelkopf zu schützen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um das Band am Sprunggelenk zu durchtrennen.Falten Sie dann das Kniegelenk nach hinten, um den Oberschenkelknochen und das Schienbein freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette und einer Schere alle Muskeln, Sehnen und anderes Gewebe, das mit den Knochen verbunden ist. Stechen Sie das Mark mit einer 5-Millimeter-Nadelspritze durch beide Knochenenden, um die Markmatrix zu lösen.Verwenden Sie nun eine frische Spritze, um das Knochenmark mit 10-15 Millilitern RPMI-Medien auszuspülen. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 300 g für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5-10 Millilitern Lysepuffer für rote Blutkörperchen.Fügen Sie der Mischung nach dem Inkubieren der Suspension das vierfache Volumen von HBSS hinzu. Dann zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600 g. Verwenden Sie das resultierende Pellet zur weiteren Verwendung.Isolieren Sie die Neutrophilen zuerst mit dem Rattenknochenmark-Neutrophilen-Isolationskit. Schichten Sie 2 Milliliter 80-55% pro col Reagenz in ein 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen, um einen Dichtegradienten zu erzeugen. Pipettieren Sie dann die isolierten Neutrophilen oder die Resuspensionslösung von Zellen, die mit dem Rattenknochenmark-Neutrophilen-Isolationskit isoliert wurden, in das Röhrchen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g 40 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Sammeln Sie mit einer sterilen Pipette die 70%-Gradientenschicht, einschließlich der Zellschichten an der 65-70%-Grenze. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Geben Sie 15 Milliliter HBSS in das Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um den Inhalt zu mischen. Zum Schluss zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Für den einstufigen Prozess zentrifugieren Sie nach dem Pipettieren der Knochenmarksuspension direkt in das Dichtegradientenröhrchen wie zuvor gezeigt.Pipettieren Sie als Nächstes die 70%-Gradientenschicht heraus, einschließlich der Schichten an der 75-70%-Gradientengrenze. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 10 Millilitern HBSS. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g, um die Zellen zu pelletieren.Zählen Sie die isolierten Neutrophilen mit einem Hämozytometer und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung. Die zweistufige Methode hatte einen erhöhten Reinheitsgrad von 90 % im Vergleich zu den 50 %, die mit der einstufigen Methode erreicht wurden.

Research

JoVE Journal

Biology

One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...