Name: שיטה חד-שלבית ודו-שלבית לבידוד נויטרופילים של חולדות לקצירת מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs)
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

one and two-step method of rat neutrophil isolation for harvesting neutrophil extracellular traps (nets)

מח עצם חולדה יעיל בידוד מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

Author Spotlight: שיטה אופטימלית לבידוד נויטרופילים של חולדות ורשתות ממח עצם

גישה ייחודית לבידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה עם קיבולת דומה

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

שיטה חד-שלבית ודו-שלבית לבידוד נויטרופילים של חולדות לקצירת מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs)

כדי להתחיל את קציר מח העצם, השרו חולדה שעברה המתת חסד באתנול 75% כדי לעקר את הפרווה והעור. השכיבו את החולדה על גבה וקטעו את הגפיים התחתונות בירך כדי להגן על ראש עצם הירך. השתמש מספריים דיסקציה לחתוך דרך הרצועה במפרק hock.לאחר מכן קפלו את מפרק הברך לאחור כדי לחשוף את עצם הירך והשוקה. בעזרת זוג מלקחיים ומספריים, הסירו בזהירות את כל השרירים, הגידים ורקמות אחרות המחוברות לעצמות. תקעו את המח דרך שני קצוות העצם בעזרת מזרק מחט 5 מ"מ כדי לשחרר את מטריצת המח.עכשיו להשתמש מזרק טרי כדי לשטוף את מח העצם עם 10-15 מיליליטר של מדיה RPMI. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 300G במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-5-10 מיליליטר של מאגר ליזה של תאי דם אדומים.לאחר הדגירה על המתלים, מוסיפים פי ארבעה נפח HBSS לתערובת. לאחר מכן צנטריפוגו את התאים ב-600G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בגלולה המתקבלת לשימוש נוסף.בודדו תחילה את הנויטרופילים בעזרת ערכת בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה. שכבה 2 מיליליטר של 80-55% לכל מגיב col בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, ליצירת שיפוע צפיפות. לאחר מכן הכניסו את הנויטרופילים המבודדים, או את תמיסת ההשעיה של תאים שבודדו באמצעות ערכת בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה, לתוך הצינור.צנטריפוגה את הצינור ב 800G למשך 40 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה סטרילית, אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול 65-70%. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר.הוסיפו 15 מיליליטר HBSS לצינור והפכו בעדינות כדי לערבב את תכולתו. לבסוף, צנטריפוגה את הצינור ב 300G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים. עבור התהליך החד-שלבי, לאחר החדרת מתלה מח העצם ישירות לתוך צינור שיפוע הצפיפות, צנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן.לאחר מכן, גופפו החוצה את שכבת 70% מעבר הצבע, כולל השכבות בגבול מעבר הצבע של 75-70%. העבר את מתלה התא הזה לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר HBSS. לאחר מכן צנטריפוגו את הצינור ב-400G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרוף את התאים.ספרו את הנויטרופילים המבודדים באמצעות המוציטומטר, והעריכו את כדאיות התא באמצעות צביעה כחולה טריפאן. לשיטת שני השלבים הייתה רמת טוהר משופרת של 90% ביחס ל-50% שהושגו בשיטת הצעד האחד.

Research

JoVE Journal

Biology

One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...