Name: Nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) toplanması için bir ve iki aşamalı sıçan nötrofil izolasyonu yöntemi
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

one and two-step method of rat neutrophil isolation for harvesting neutrophil extracellular traps (nets)

Verimli Sıçan Kemik İliği Nötrofil Hücre Dışı Tuzak İzolasyonu

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

Yazar Spotlight: Kemik İliğinden Sıçan Nötrofillerini ve NET'leri İzole Etmek İçin Optimize Edilmiş Yöntem

Karşılaştırılabilir Kapasiteye Sahip Sıçan Kemik İliği Nötrofillerini İzole Etmek için Benzersiz Yaklaşım

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

Watch this Scientific Journal Video about One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps NETs at JoVE.com

Nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) toplanması için bir ve iki aşamalı sıçan nötrofil izolasyonu yöntemi

Kemik iliği hasadına başlamak için, kürkü ve cildi sterilize etmek için ötenazi yapılmış bir fareyi% 75 etanole batırın. Fareyi sırt üstü yatırın ve femur başını korumak için kalçadaki alt ekstremiteleri kesin. Diz eklemindeki bağı kesmek için diseksiyon makası kullanın.Ardından uyluk kemiği ve kaval kemiğini ortaya çıkarmak için diz eklemini geriye doğru katlayın. Bir forseps ve makasla, kemiklere bağlı kasları, tendonları ve diğer dokuları dikkatlice çıkarın. Kemik iliği matrisini gevşetmek için 5 milimetrelik iğneli bir şırınga ile iliği her iki kemik ucundan geçirin.Şimdi kemik iliğini 10-15 mililitre RPMI ortamıyla yıkamak için taze bir şırınga kullanın. Kemik iliği hücrelerini 300G'de 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 5-10 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin.Süspansiyonu inkübe ettikten sonra, karışıma HBSS hacminin dört katını ekleyin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600G'de santrifüjleyin. Elde edilen peleti daha fazla kullanım için kullanın.Nötrofilleri önce sıçan kemik iliği nötrofil izolasyon kiti ile izole edin. Bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde col reaktifi başına% 80-55 mililitre katman. Daha sonra izole edilmiş nötrofilleri veya sıçan kemik iliği nötrofil izolasyon kiti ile izole edilmiş hücrelerin resüspansiyon solüsyonunu tüpe pipetleyin.Tüpü 800G'de 20 santigrat derecede 40 dakika santrifüjleyin. Steril bir pipetle, %65-70 sınırındaki hücre katmanları da dahil olmak üzere %70 gradyan katmanını toplayın. Hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.Tüpe 15 mililitre HBSS ekleyin ve içeriğini karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Son olarak, hücreleri peletlemek için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin. Tek adımlı işlem için, kemik iliği süspansiyonunu doğrudan yoğunluk gradyan tüpüne pipetledikten sonra, daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin.Ardından, %75-70 gradyan sınırındaki katmanlar da dahil olmak üzere %70 gradyan katmanını pipetleyin. Bu hücre süspansiyonunu 10 mililitre HBSS içeren yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra hücreleri peletlemek için tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400G'de santrifüjleyin.İzole edilmiş nötrofilleri bir hemositometre kullanarak sayın ve tripan mavisi boyama yoluyla hücre canlılığını değerlendirin. İki aşamalı yöntem, tek aşamalı yöntemle elde edilen %50'ye kıyasla %90'lık gelişmiş bir saflık seviyesine sahipti.

Research

JoVE Journal

Biology

One and Two-Step Method of Rat Neutrophil Isolation for Harvesting Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...