Till att börja med pipetterar 50 mikroliter av de isolerade rått-NET-proverna till ett rör med 450 mikroliter Tris-EDTA-buffert. Pipettera nu 100 mikroliter av DNA-standarden och proverna i en 96-hålsplatta. Tillsätt en lika stor volym analysreagens i brunnarna.
Inkubera sedan plattan i rumstemperatur i två till fem minuter, undvik exponering för direkt ljus. Placera plattan i en fluorescensmikroplattläsare. Ställ in ett emissionsspektrum på cirka 530 nanometer och ett absorberande spektrum på cirka 480 nanometer.
Inkubera cellerna i en mikroliter av en kärnfärgning i 30 minuter. Inkubera sedan cellerna i en mikroliter cellfri DNA-stam i 10 minuter. Blanda försiktigt de fluorescerande färgämnena.
Ladda sample plattan i cytometern. Växla till SYTOX Green-kanal och välj sedan HEXT-kanalen. Ställ in belysningen på blå 377/447 och justera exponeringstiden till 300 000 mikrosekunder.
Klicka på Fokuserad inställning och klicka sedan på Registrera automatiskt för att automatiskt justera fokus. Välj SYTOX Green-kanalen och ställ in belysningen på Green 483/536. Ställ in exponeringstiden för SYTOX Green till 30 000 mikrosekunder.
Klicka på Starta skanning för att påbörja skanningsprocessen. Jämförbara svar i NET-sekretion kunde urskiljas mellan perifera neutrofiler och benmärgsneutrofiler oberoende av PMA-stimulering. Råttnät uppvisade också begränsade tvärbindningsmöjligheter med varandra.
Inkubation med PMA ledde till en 10-procentig ökning av cellfritt DNA-innehåll efter fyra timmar, vilket indikerar en högre benägenhet att utlösa NET-bildning.