כדי להתחיל, לדלל בקבוקון של מטריצת קרום מרתף קר מופשר עם 12 מיליליטר של DM EM F12. מערבבים היטב את המתלים. הוסיפו מכסה אחד לכל באר של צלחת בת 24 בארות.
לאחר מכן, פיפטה 250 מיקרוליטר של פתרון מטריצה מדולל לתוך כל באר. יש להשליך את מדיום התרבית של לוחות תאי אפיתל פיגמנט של פיגמנט הרשתית בתרבית. לשטוף את הצלחות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS שחומם מראש לכל באר.
לאחר מכן, להוסיף 0.5 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה התא לבארות של לוחות התרבית, לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי ליזום עיכול. לאחר הדגירה, להתבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את סוף העיכול. עכשיו עם פיפטה של מיליליטר אחד, פיפטה עדינה את תרחיף התא למעלה ולמטה 10 פעמים.
מוסיפים מדיום תרבית שחומם מראש כדי לדלל את המתלים. לאחר מכן, צנטריפוגר אותו ב 250 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את הסופרנאטנט מצינור הצנטריפוגה.
לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של מדיום התרבית. השתמש פיפטה כדי לערבב את התאים 10 עד 15 פעמים. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
לאחר מכן, לספור את תאי אפיתל פיגמנט הרשתית. שאפו את תמיסת הציפוי לפני הציפוי. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד ממדיום התרבית לכל באר וזורעים את התאים על פתקי הכיסוי.
לאחר שילוב וצביעה של EDU, צלם את התמונות של חמישה שדות אקראיים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשב את אחוז התאים החיוביים של EDU. לאחר מכן, התווה את עקומות זמן הפרופורציה המתאימות כדי ליצור עקומת צמיחה.
לבסוף, קבע את חלון ההקפאה מהשלב המעריכי עבור כל קו תא. תאי אפיתל פיגמנט הרשתית איבדו בתחילה את המורפולוגיה המשושה האופיינית להם, אך מאוחר יותר השיבו אותה בשלב המעריכי של הצמיחה. כאשר התאים גודלו בתרבית במשך שבוע נוסף, התפשטות התאים פחתה.
בדיקת התפשטות EDU אישרה כי תאי P2 ביום חמישה הציגו קצב התפשטות גבוה יותר, בעוד שתאי P2 ביום 11 נכנסו לשלב ההאטה.