للبدء ، ضع حشوات زراعة الخلايا في لوحة محول زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. قم بتغطية الجانب القمي من الإدخالات مسبقا ب 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي خارج الخلية أو BME في وسائط نمو معوية. قم بتغطية ملحق إضافي لاستخدامه كعنصر تحكم أثناء قياسات سلامة الحاجز.
بعد ذلك ، احتضان الملحق المطلي عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بنضح وسيط الثقافة المعوية 3D. احصد الأمعاء اللفائفية البقرية في 1 ملليلتر من وسائط الغسيل المثلجة.
استخدم مكشطة خلوية لفصل القباب وجمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. مع طرف ماصة 1 ملليلتر ، سحن 30 مرة لتوليد شظايا معوية. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لمزيد من السحن حوالي 40 مرة لتفتيت شظايا المعوية.
قم بتكوين حجم الأنبوب إلى 10 ملليلتر باستخدام وسائط الغسيل الباردة الثلجية. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 300 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشاق بعناية طاف ، بما في ذلك طبقة BME.
بعد ذلك ، لكل أربع قباب ، أعد تعليق الحبيبات في 1 ملليلتر من إنزيم TrypLE Express المسخن مسبقا. انقل الخليط إلى طبق من 24 بئرا واحتضنه عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق. ماصة بلطف الخليط مع ماصة 1 ملليلتر لمزيد من تحطيم الأمعاء.
ثم ماصة الخليط مع ماصة 200 ميكرولتر لتقسيم الشظايا إلى خلايا واحدة. استخدم حقنة سعة 3 ملليلتر مزودة بإبرة معقمة قياس 22 لشفط وتوزيع تعليق الخلية أربع مرات لتحقيق تعليق خلية واحدة. باستخدام المجهر ، راقب تفكك الخلايا حتى يتم تقسيم 80٪ من المعوية إلى خلايا مفردة.
الآن جمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف أربعة مجلدات من وسائط غسيل FBS لإخماد التفاعل. ثم قم بتصفية المعوية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر مغلفة مسبقا مرتين في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي التعليق في 300 غرام لمدة خمس دقائق لإخراج الخلايا. نضح المادة الطافية في أنبوب الطرد المركزي لتعليق الخلايا المعوية اللفائفية البقرية المنفصلة. أعد تعليق الحبيبات في حجم صغير من وسائط النمو العضوية.
بعد ذلك ، استخدم طريقة استبعاد صبغة Trypan Blue ومقياس الدم لتحديد صلاحية الخلية. قم بإزالة أي محلول طلاء زائد بعناية من ملحق زراعة الخلية. قم بزرع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المفردة على السطح القمي لإدراج ثقافة مطلي مسبقا.
أضف الآن 700 ميكرولتر من وسائط FBS الكاملة إلى الجانب الجانبي القاعدي من الملحق. حرك اللوحة حوالي 10 مرات على شكل الرقم ثمانية لتوزيع الخلايا بالتساوي على الملحق. ثم ضع اللوحة على جهاز تدفئة اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 10 دقائق.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 48 ساعة. بعد الحضانة ، استبدل الوسائط الموجودة على المكونات القمية والقاعدية بوسائط نمو معوية جديدة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسائط من المقصورات الجانبية القمية والقاعدية.
اغسل الملحق بعناية باستخدام PBS واستبدله بوسائط تمايز معوية ، تستكمل فقط بمثبطات. لوحظ تكوين الغلاف المعوي بعد ساعات قليلة من استزراع خبايا الأبقار المطلية. بعد يومين ، تم تحديد تجويف الكرات بشكل جيد ، مع ملاحظة الهياكل الناشئة في اليوم الرابع.
لوحظت المعوية الناضجة في اليوم السابع. أظهر التلوين المناعي للمعوية 3D البالغة من العمر سبعة أيام وجود سلالات خلايا مختلفة. تم توطين بروتين E-cadherin عند تقاطع الالتصاق.
كانت المعوية إيجابية لخلايا الغدد الصم المعوية وخلايا بانيث المنتجة للليزوزيم. لوحظت أحاديات 2D المتقاربة في أقل من أسبوع واحد من الثقافة.
