Pour commencer, placez les inserts de culture cellulaire dans une plaque d’adaptation de culture tissulaire à 24 puits. Pré-enduisez la face apicale des inserts avec 100 microlitres de matrice extracellulaire de membrane basale ou BME dans un milieu de croissance entéroïde. Enduisez un insert supplémentaire pour l’utiliser comme contrôle lors des mesures d’intégrité de la barrière.
Ensuite, incubez l’insert enduit à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Une fois l’incubation terminée, aspirer le milieu de culture entéroïde 3D. Récoltez les entéroïdes iléaux bovins dans 1 millilitre de milieu de lavage glacé.
Utilisez un grattoir à cellules pour détacher les dômes et les recueillir dans un tube conique de 15 millilitres. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 millilitre, triturez 30 fois pour générer des fragments d’entéroïdes. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour triturer davantage environ 40 fois pour briser les fragments entéroïdes.
Complétez le volume du tube à 10 millilitres avec un produit de lavage glacé. Centrifugez ensuite le tube à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant, y compris la couche BME.
Ensuite, tous les quatre dômes, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre d’enzyme TrypLE express préchauffée. Transférez le mélange dans une plaque à 24 puits et incubez à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Pipeter doucement le mélange avec une pipette de 1 millilitre pour décomposer davantage les entéroïdes.
Pipetez ensuite le mélange avec une pipette de 200 microlitres pour casser les fragments en cellules individuelles. Utilisez une seringue de 3 millilitres munie d’une aiguille stérile de calibre 22 pour aspirer et distribuer la suspension cellulaire quatre fois afin d’obtenir une suspension à cellule unique. À l’aide d’un microscope, surveillez la dissociation cellulaire jusqu’à ce que 80 % des entéroïdes soient décomposés en cellules individuelles.
Maintenant, collectez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez quatre volumes de média de lavage FBS pour éteindre la réaction. Filtrez ensuite les entéroïdes à travers une crépine cellulaire pré-enrobée de 40 micromètres deux fois dans un tube conique de 50 millilitres.
Centrifugez la suspension à 300 g pendant cinq minutes pour extraire les cellules. Aspirer le surnageant dans le tube à centrifuger d’une suspension de cellules entéroïdes iléales bovines dissociées. Remettre la pastille en suspension dans un petit volume de milieu de culture organoïde.
Ensuite, utilisez la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan et l’hémacytomètre pour déterminer la viabilité cellulaire. Retirez soigneusement tout excès de solution d’enrobage de l’insert de culture cellulaire. Ensemencer les 200 microlitres de la suspension unicellulaire sur la surface apicale d’un insert de culture pré-enrobé.
Ajoutez maintenant 700 microlitres de média complet FBS sur la face latérale basale de l’insert. Déplacez la plaque environ 10 fois en forme de chiffre huit pour répartir uniformément les cellules sur l’insert. Placez ensuite l’assiette sur le chauffe-assiette dans l’enceinte de sécurité biologique pendant 10 minutes.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone à 48 heures. Après l’incubation, remplacez le milieu sur les composants apical et basal par un milieu de croissance entéroïde frais. Le lendemain, retirez le milieu des compartiments latéraux apical et basal.
Lavez soigneusement l’insert avec du PBS et remplacez-le par un milieu de différenciation entéroïde, complété uniquement par des inhibiteurs. La formation d’entérosphères a été observée quelques heures après la culture des cryptes bovines plaquées. Après deux jours, la lumière des sphères était bien définie, avec des structures bourgeonnantes observées au quatrième jour.
Des entéroïdes matures ont été observés au septième jour. L’immunomarquage des entéroïdes 3D âgés de sept jours a montré la présence de différentes lignées cellulaires. La protéine E-cadhérine a été localisée à la jonction d’adhérence.
Les entéroïdes étaient positifs pour les cellules entéroendocrines et les cellules de Paneth productrices de lysozyme. Des monocouches 2D confluentes ont été observées en moins d’une semaine de culture.
